焉兆萍 宋士良 陸克文

摘? 要：本文對(duì)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了篩選優(yōu)化。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，確定該枯草芽孢桿菌的優(yōu)化培養(yǎng)基為：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸銨0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸亞? ?鐵0.1 g/L、碳酸鈣0.1 g/L。最適發(fā)酵條件為：初始pH 7.2，接種量5%，發(fā)酵溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌;發(fā)酵培養(yǎng)基;發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2019）01-0051-05

枯草芽孢桿菌是嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，在自然界中廣泛存在，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，且不污染環(huán)境;能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)和酶，具有廣譜抗菌活性。該菌已被我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入飼料添加劑目錄名單，越來(lái)越多地被研制成微生物制劑，其制劑作為“綠色”飼料添加劑，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)、飼料加工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，成為現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的一種常規(guī)添加劑，具有廣闊的發(fā)展前景[1]?？莶菅? 孢桿菌在動(dòng)物腸道內(nèi)具有較強(qiáng)的生物奪氧能力，這對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用、生長(zhǎng)、防病起到重要作用[2];其還可以通過(guò)產(chǎn)生抗體和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激發(fā)體液免疫與細(xì)胞免疫，從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料利用率[3]。由于枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、易于存活、無(wú)致病性，具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外已有眾多學(xué)者對(duì)此菌進(jìn)行了大量研究[4]。

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件，以最大限度地提高枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌數(shù)，降低生產(chǎn)成本，滿足工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的要求。

1? 材料與方法

1.1 供試菌種

枯草芽孢桿菌，由上海邦成生物工程有限公司菌種保藏室提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

LB液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉10 g、水? 1 000 mL，pH 7.2。

1.3 種子液的制備

將菌種接種于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化18 h后，挑取單菌落接入裝有100 mL LB液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4 液體種子生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將液體種子以1%接種量分別接入盛有100 mL種子液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h、26 h和27 h，分別取樣測(cè)其吸光度（OD600）。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選及優(yōu)化

選擇12種不同發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，種子液以2%接種量接入盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基[5-17]。

不同發(fā)酵培養(yǎng)基配方組成如下：

（1） 麥芽浸粉1 g/L、黃豆粉（過(guò)80目篩） 15 g/L、碳酸鈣6.68 g/L、硫酸錳0.4 g/L、氯化鎂2 g/L，pH 7.2。

（2） 可溶性淀粉10 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、氯化鈣0.1 g/L，pH 7.2。

（3） 玉米淀粉15.86 g/L、玉米漿干粉12.68 g/L、氯化銨19.98 g/L，pH 7.2。

（4） 蛋白胨30 g/L、甘油10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂1.5 g/L，pH 7.2。

（5） 玉米淀粉25.3 g/L、黃豆粉（過(guò)80目篩）49.5 g/L、酵母膏13 g/L、磷酸氫二鉀1.1 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、氯化鈣0.1 g/L、硫酸錳0.1 g/L，pH 7.2。

（6） 葡萄糖15 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸鎂5 g/L，pH 7.2。

（7） 酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、蔗糖12 g/L、氯化鈉5 g/L，pH 7.2。

（8） 玉米淀粉15 g/L、玉米漿干粉12 g/L、酵母膏1.5 g/L、氯化銨3 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、硫酸錳0.15 g/L、氯化鈣0.1 g/L，pH 7.2。

（9） 蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏粉5 g/L、磷酸氫二鉀? 2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L，pH 7.2。

（10） 豆粕20 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉10 g/L，pH 7.0。

（11） 豆粕20 g/L、葡萄糖5 g/L、玉米淀粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸亞鐵0.1 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、硫酸錳0.2 g/L，pH 7.0。

（12） 玉米淀粉20 g/L、蛋白胨5 g/L、豆粕10 g/L、硫酸銨0.5 g/L、碳酸鈣1 g/L，pH 7.0。

1.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.6.1 最佳培養(yǎng)溫度的測(cè)定

采用篩選出的10號(hào)培養(yǎng)基，液體種子以2%接種量接入盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 mL三角瓶中，分別在30 ℃、35 ℃、 37 ℃和40 ℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)? 72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.6.2 最佳生長(zhǎng)pH的測(cè)定

采用篩選出的10號(hào)培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)至6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，種子液以2%接種量接入盛有100 mL發(fā) 酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，確定最佳初始pH。

1.6.3 接種量的影響

采用篩選出的10號(hào)培養(yǎng)基，將種子液接種量分別調(diào)節(jié)為搖瓶裝液體積的1%、2%、5%、7%和10%，37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，確定最適接種量。

1.6.4 裝液量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

采用篩選出的10號(hào)培養(yǎng)基，種子液以2%接種量分別接入裝有50 mL、75 mL、? ? ?100 mL、125 mL、150 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，確定最適裝液量。

1.6.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

采用篩選出的10號(hào)培養(yǎng)基，液體種子以2%接種量接入盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的? ? ? 500 mL三角瓶中，37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為150 r/min、180 r/min、200 r/min和250 r/min，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，確定最適轉(zhuǎn)速。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在確定好發(fā)酵培養(yǎng)基碳源與氮源的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)表[L9（33）]進(jìn)行試驗(yàn)。種子液以5%接種量接入裝有? ?50 mL初始pH 7.2液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，35 ℃條件下250 r/min搖床培養(yǎng)? 72 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌株在LB液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)時(shí)間為23 h時(shí)的OD600為最大值，因此選擇培養(yǎng)23 h為液體種子生長(zhǎng)時(shí)間。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

培養(yǎng)基的篩選結(jié)果見表1。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，10號(hào)培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，細(xì)菌總數(shù)最高值為40.5億CFU/mL。因此可選用10號(hào)培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響

35 ℃培養(yǎng)發(fā)酵菌數(shù)最高，37 ℃次之，30 ℃和40 ℃條件下發(fā)酵細(xì)菌總數(shù)明顯較低。因此，選擇35 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.3.2 初始pH對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響

搖瓶發(fā)酵中pH難以控制，一般控制其初始pH。初始pH 7.0時(shí)發(fā)酵菌數(shù)為35億CFU/mL，初始pH 7.2時(shí)發(fā)酵菌數(shù)可達(dá)到39億CFU/mL，明顯高于其他初始pH的發(fā)酵菌數(shù)，因此選擇適宜初始pH為7.2。

2.3.3 接種量對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響

分別采用1%、2%、5%、7%和10%五個(gè)接種量梯度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。一定范圍內(nèi)，發(fā)酵菌數(shù)隨接種量的增加而增加，5%接種量以上發(fā)酵菌數(shù)不再增加，因此5%接種量為最適接種量。

2.3.4 裝液量對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響

裝液量越多發(fā)酵菌數(shù)越低?？莶菅挎邨U菌為需氧菌，在一定培養(yǎng)條件下，裝液量越少發(fā)酵菌數(shù)越高。因此選擇最適搖瓶裝液量為50 mL。

2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響

搖床轉(zhuǎn)速越高發(fā)酵菌數(shù)越大。轉(zhuǎn)速小，通氣量小，不利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。因此該菌的適宜搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為250 r/min。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳源與氮源優(yōu)化的正交試驗(yàn)因素水平? 見表2，優(yōu)化結(jié)果見表3。從表中可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕、葡萄糖和玉米粉的用量對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)均產(chǎn)生一定影響，從極差R的大小來(lái)看，各因子作用的主次順序?yàn)锳>C>B，即豆粕的用量對(duì)菌體增殖的影響最為顯著，玉米粉次之，葡萄糖影響最小。以發(fā)酵菌數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最佳表現(xiàn)組合為A2B1C2，即豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L為碳源、氮源用量的最佳組合。

3? 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成對(duì)菌株的生長(zhǎng)有很大影響。本文采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，確定該枯草芽孢桿菌的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L。最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度35 ℃，初始pH 7.2，接種量5%，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min。采用此種配比發(fā)酵培養(yǎng)72 h后細(xì)菌總數(shù)可達(dá)162億CFU/mL，本試驗(yàn)結(jié)果為大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了有益借鑒。

參考文獻(xiàn)：（17篇，略）