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      新疆藥桑總黃酮的富集純化工藝研究

      2019-06-11 05:31:37何倩蘇比努爾李俊輝
      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年4期
      關(guān)鍵詞:富集總黃酮

      何倩 蘇比努爾 李俊輝 等

      摘要 [目的]通過對大孔樹脂的篩選和單因素考察,對藥桑總黃酮純化富集工藝進(jìn)行優(yōu)化。[方法]選擇靜態(tài)吸附-解吸試驗篩選純化藥??傸S酮的大孔樹脂型號,采用紫外法測定總黃酮含量。進(jìn)一步根據(jù)上樣液流速、上樣液質(zhì)量濃度、pH、洗脫劑用量及洗脫劑流速確定最優(yōu)富集工藝;采用高效液相色譜法進(jìn)行主要成分檢測,從而對單體成分含量進(jìn)行控制。[結(jié)果]AB-8型大孔樹脂對藥桑黃酮的吸附與洗脫性能較好,最優(yōu)純化條件為藥液濃度0.208 mg/mL、pH 4、上樣液流速1.5 mL/min,再用70%乙醇溶液40 mL進(jìn)行洗脫。[結(jié)論]AB-8型大孔樹脂可有效富集、純化藥??傸S酮,通過HPLC進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控可保證純化工藝穩(wěn)定可行。

      關(guān)鍵詞 藥桑;總黃酮;大孔樹脂;富集;純化工藝

      中圖分類號 R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

      文章編號 0517-6611(2019)04-0176-05

      藥桑在植物學(xué)分類上屬桑科(Moraceac)桑屬(Morus L.)黑桑種(Morus nigra Linn.)[1],是植物藥桑樹的成熟果穗,集中分布在新疆阿克蘇、和田、喀什等地區(qū),也是新疆傳統(tǒng)民間藥材[2],《本草綱目》中記載“桑果實常用可起活血補腦、通脈護(hù)肝、強生健體、強腎利尿、降壓降脂、解酒護(hù)肝的作用,可治麻疹、水痘、咽炎、氣管炎、口舌生瘡、牙周炎等疾病”?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,新疆藥桑具有提高人體免疫力、降血壓、降血脂、降血糖、美顏抗衰老等作用[3-5],是珍貴的藥食兩用資源。

      現(xiàn)今,隨著國內(nèi)外對藥桑藥用價值及藥理活性的研究深入,發(fā)現(xiàn)藥桑中含有多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等活性成分[6-7]。傅大煦[1]對新疆桑椹的抗高血壓活性篩選中發(fā)現(xiàn)其有效部位為花色苷等黃酮類成分,認(rèn)為其作用主要與黃酮類化合物的抗氧化作用有關(guān)。因此黃酮類組分可能是藥桑發(fā)揮藥理作用的重要活性物質(zhì),但關(guān)于藥桑黃酮類物質(zhì)的分離純化技術(shù)鮮見報道,這直接影響到后續(xù)藥桑產(chǎn)品的開發(fā)成本及質(zhì)量。筆者對藥桑中總黃酮化合物的提取及純化工藝進(jìn)行研究,選用5種不同物理和化學(xué)性能的大孔樹脂,以樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸率為考察指標(biāo),確定適宜純化藥??傸S酮的樹脂類型;然后依次考察樹脂吸附因素(吸附液pH、上樣量及濃度、流速)對藥??傸S酮吸附量的影響,通過考察洗脫液體積及流速評價樹脂對藥桑黃酮的洗脫能力,采用高效液相色譜法對經(jīng)過最佳吸附條件進(jìn)行富集的藥桑黃酮進(jìn)行質(zhì)量控制,最終確定最佳富集條件。

      1 材料與方法

      1.1 材料 新疆藥桑(Morus nigra Linn.),采集成熟期藥桑,由新疆醫(yī)科大學(xué)中藥教研室徐海燕副教授鑒定為??坪谏7N。無水乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;甲醇,天津永晟精細(xì)化工有限公司;AB-8、D-101、LX-17、LX-30、LSA-12型大孔樹脂,西安藍(lán)曉科技有限公司;蘆丁對照品、槲皮素對照品、白藜蘆醇對照品、綠原酸對照品,上海源葉生物科技有限公司。

      1.2 儀器 UV-2700紫外-可見分光光度計(日本島津);Waters e2695高效液相色譜儀(美國waters);R1001-VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);KQ3200DE電熱恒溫水浴鍋(昆山市超聲儀器有限公司);TDL-5A 離心機(上海江儀儀器有限公司);恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

      1.3 方法

      1.3.1 藥??傸S酮的提取及含量測定。稱取干燥處理、過40目篩的藥桑粉末約2.0 g置于圓底燒瓶,加入70%乙醇80 mL,在80 ℃水浴下回流提取2次,每次60 min,合并濾液濃縮至1/2體積。濾過置100 mL容量瓶中,用70%乙醇定容,得到藥??傸S酮粗提液備用。

      1.3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密稱取烘干至恒重的蘆丁對品5 mg,用60%乙醇溶解,定容到25 mL,配成0.2 mg/mL的蘆丁對照溶液,準(zhǔn)確量取0、1、2、3、4、5 mL的對照品儲備溶液分別置于10 mL容量瓶中,各加入60%乙醇至5 mL,再依次加入濃度為5%的NaNO2 溶液 0.3 mL搖勻,放置6 min, 后加入濃度為10%的 Al(NO3)3溶液0.3 mL,放置6 min,然后加入4%的 NaOH溶液4 mL,放置15 min,60%乙醇定容至10 mL。在波長為505 nm下測吸光度(A)。以吸光度(A)為橫坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.1.2 藥桑總黃酮含量測定。精密吸取總黃酮提取液2 mL 置于25 mL具塞試管中,加入3 mL乙醇搖勻,加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,搖勻靜置6 min,再加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min,加入4 mL 4% NaOH溶液后搖勻靜置15 min,加入0.4 mL乙醇溶液使具塞試管中液體總體積為10 mL。在505 nm處測定吸光度值,然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算藥??傸S酮的含量??傸S酮含量(mg/g)=(Y×V)/W、總黃酮提取率=(Y×V)/(W×103)×100%,其中,Y為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出的藥??傸S酮的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為原浸提液體積(mL);W為提取用的藥桑粉末的質(zhì)量(g)。

      1.3.2 藥??傸S酮的純化。

      1.3.2.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理。將5種不同型號樹脂(AB-8、D-101、LX-17、LX-30、LSA-12)在95%乙醇中浸泡24 h,隔段時間用玻璃棒攪拌,使得樹脂和乙醇充分接觸并趕走空氣,濕法裝柱用蒸餾水洗滌至中性;然后加入5%的HCl溶液浸泡12 h,用蒸餾水洗至中性;最后加入5% NaOH溶液浸泡12 h后,用蒸餾水洗至中性,備用。

      1.3.2.2 靜態(tài)吸附試驗及相關(guān)指標(biāo)的計算。準(zhǔn)確量取15 mL已預(yù)處理好的5種不同型號的大孔吸附樹脂置于錐形瓶中,各加入40 mL藥桑粗提液,置于搖床上振蕩24 h,過濾取過濾液測定其中總黃酮的質(zhì)量濃度,計算吸附量、吸附率。再將已吸附的大孔樹脂置于錐形瓶,再加入70%乙醇40 mL置于25 ℃恒溫振蕩器振蕩2 h,過濾測定解吸液中總黃酮含量,計算解吸率。靜態(tài)吸附量=(吸附前樣品總黃酮含量-吸附后濾液總黃酮含量)/樹脂體積、解吸率=解吸液總黃酮含量/(吸附前樣品總黃酮含量-吸附后濾液總黃酮含量)×100%。

      1.3.2.3 藥??傸S酮對AB-8樹脂吸附及解吸的影響。根據(jù)靜態(tài)吸附試驗相關(guān)指標(biāo)的計算,該試驗確定了AB-8大孔樹脂對藥桑黃酮組分吸附效果最好,因此進(jìn)一步采用動態(tài)法比較AB-8大孔樹脂對藥桑黃酮成分的最佳上樣濃度、上樣流速、上樣液pH以及洗脫劑濃度、洗脫體積對目標(biāo)成分的富集分離最佳條件。

      (1)樣品液質(zhì)量濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響。用靜態(tài)吸附試驗中吸附能力最強的AB-8大孔吸附樹脂,分別飽和吸附質(zhì)量濃度為0.084、0.125、0.167、0.208、0.252 mg/mL體積為60 mL、pH為4的藥桑黃酮提取液,根據(jù)其吸附量計算樹脂對藥桑黃酮的吸附率,確定上樣液的最佳質(zhì)量濃度。

      (2)上樣液流速對AB-8樹脂吸附效果的影響。取pH為4、質(zhì)量濃度為0.208 mg/mL藥桑黃酮提取液60 mL,分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速通過AB-8大孔吸附樹脂,準(zhǔn)確測定藥桑黃酮質(zhì)量濃度,根據(jù)吸附率選擇最佳上樣流速。

      (3)上樣液pH對AB-8樹脂吸附效果的影響。取質(zhì)量濃度0.208 mg/mL藥桑黃酮提取液60 mL,以1.5 mL/min的流速通過AB-8大孔樹脂,通過柱體時調(diào)節(jié)藥桑溶液pH分別為1、2、3、4、5,根據(jù)吸附率選擇最佳的上樣液pH。

      (4)洗脫劑濃度對AB-8樹脂解吸藥??傸S酮效果的影響。取質(zhì)量濃度0.208 mg/mL、pH調(diào)節(jié)為4的藥桑黃酮提取液60 mL,以1.5 mL/min的流速通過AB-8大孔樹脂,選擇10%、30%、50%、70%、90% 5種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液兩倍柱體積下洗脫,根據(jù)解吸率選擇最佳洗脫劑濃度。

      (5)洗脫劑用量對AB-8樹脂解吸藥桑總黃酮效果的影響。取質(zhì)量濃度0.208 mg/mL、pH調(diào)節(jié)為4的藥桑黃酮提取液60 mL,以1.5 mL/min的流速通過AB-8大孔樹脂,選擇20、40、60、80和100 mL的70%乙醇溶液進(jìn)行過柱洗脫,根據(jù)解吸率選擇最佳洗脫劑用量。

      1.3.3 高效液相色譜法驗證富集純化工藝。

      1.3.3.1 色譜條件。色譜柱:大連伊力特C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.1 %甲酸(B);梯度洗脫程序:0~40 min,20%A~80%A;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;檢測波長335 nm。

      1.3.3.2 對照品的制備。精密稱取對照品蘆丁9.87 mg、槲皮素11.80 mg、綠原酸10.01 mg、白藜蘆醇9.96 mg置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度作為對照品儲備液;精密吸取一定比例的對照品儲備液,混合均勻后制得蘆丁20 μg/mL、槲皮素0.06 μg/mL、綠原酸15.50 μg/mL、白藜蘆醇1.18 μg/mL的混標(biāo)溶液,在水浴鍋上蒸干備用。

      1.3.3.3 供試品的制備。在“1.3.3.2”試驗基礎(chǔ)上,精密稱取藥桑提取液烘干后的粉末10.11 mg,置于10 mL容量瓶中,在超聲條件下用甲醇溶解定容,在水浴鍋上蒸干備用。

      1.3.3.4 方法學(xué)考察。

      (1)專屬性。按“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)樣,得到對照品溶液和藥桑提取供試品樣液HPLC色譜圖,根據(jù)圖譜各峰保留時間等考察試驗專屬性。

      (2)線性關(guān)系。吸取對照品儲備液1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 mL 至10 mL容量瓶中,甲醇稀釋定容制備成一系列對照品溶液。按“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)行測定,并記錄峰面積,以峰面積對對照品濃度進(jìn)行線性回歸,計算回歸方程。

      (3)精密度。精密吸取綠原酸、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素濃度分別為4.5、10.0、0.3、0.046 μg/mL的混合對照品溶液1 mL,按“1.3.2.1”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次,記錄峰面積,計算RSD值考察儀器精密度。

      (4)重復(fù)性。精密稱取藥桑過注后烘干粉末50 mg,用甲醇稀釋定容至10 mL容量瓶,按“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)樣,重復(fù)以上操作5次,記錄峰面積并計算含量,計算RSD值考察方法的重復(fù)性。

      (5)穩(wěn)定性。取同一供試品溶液,分別在0、1、4、8、24 h時按“1.3.2.1”的色譜條件測定,記錄峰面積,計算RSD值考察樣品穩(wěn)定性。

      (6)加樣回收試驗。精密稱取已知藥桑粉末50 mg置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容并在100 W超聲條件下超聲10 min,吸取已知濃度的混標(biāo)溶液并加入。按照“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)樣,計算各對照品加樣回收率及RSD值。

      1.3.3.5 樣品測定。分別精密稱取過柱前、后藥桑粉末約50 mg置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容并在100 W超聲條件下超聲10 min。按照“1.3.2.1”色譜條件進(jìn)樣,計算各成分純度。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 藥桑總黃酮含量的測定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,按“1.3.1.2”操作得到其吸光度,最終得回歸方程Y=11.831 4x-6.19×10-4(R2=0.999 7),表明蘆丁在0~1 mg/mL 呈良好線性關(guān)系。

      在505 nm處測定吸光度,然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算藥??傸S酮的含量為20.46 mg/g,RSD=1.08%(n=3),提取率為10.18%,RSD=1.58%(n=3)。

      2.2 藥桑總黃酮的富集純化

      2.2.1 樹脂的篩選。5種大孔吸附樹脂對藥??傸S酮的吸附、解吸性能見表1。由表1可知,AB-8和D-101的靜態(tài)吸附量和吸附率均高于其他型號樹脂,而AB-8的解析量和解吸率較其他型號樹脂高,綜合考慮吸附和解吸能力,確定此次試驗選用AB-8 型大孔樹脂純化藥??傸S酮。

      2.2.2 藥??傸S酮對AB-8樹脂吸附及解吸的影響。

      2.2.2.1 樣品液質(zhì)量濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響。從圖1可以看出,當(dāng)上樣液濃度在0.084~0.208 mg/mL時,樹脂的吸附率隨著上樣液濃度增加而提高,隨著濃度進(jìn)一步增大,吸附率反而呈降低的趨勢。其原因可能為高濃度的上樣液會使得黃酮組分超載導(dǎo)致通過柱床的速度減慢,不能被及時吸附,因此選擇上樣液的質(zhì)量濃度0.208 mg/mL。

      2.2.2.2 上樣液流速對AB-8樹脂吸附效果的影響。從圖2可以看出,上樣液的流速對藥??傸S酮吸附率的影響較大。當(dāng)流速為1.5 mL/min時,其吸附率達(dá)到最大,隨著繼續(xù)增大,吸附率呈下降趨勢。因此最佳的上樣流速為1.5 mL/min。

      2.2.2.3 上樣液pH對AB-8樹脂吸附效果的影響。從圖3可以看出,當(dāng)pH為4時,其吸附率達(dá)到最大,隨著pH的繼續(xù)增大,吸附率呈下降趨勢。因此最佳的上樣液pH為4。

      2.2.2.4 洗脫劑濃度對AB-8樹脂解吸藥??傸S酮效果的影響。從圖4可以看出,供試液經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化后,30%、50%和70%乙醇洗脫部分解吸率較高。洗脫液濃度低于30%時,一些極性大的雜質(zhì)類化合物被洗脫,造成固形物的得率高,但總黃酮的純度低,最終選用70%乙醇溶液洗脫。

      2.2.2.5 洗脫劑用量對AB-8樹脂解吸藥??傸S酮效果的影響。從圖5可以看出,洗脫劑用量對藥??傸S酮解吸率的影響較小。洗脫劑用量在40 mL以下時,隨著洗脫劑用量的增大,對AB-8樹脂的解吸率明顯增大;洗脫劑用量在40 mL以上時,解吸率增大緩慢??梢姡?0 mL洗脫液較穩(wěn)定。

      2.3 高效液相色譜法驗證富集純化工藝

      2.3.1 專屬性考察。從圖6可以看出,綠原酸、蘆丁、槲皮素分離度良好。

      2.3.2 方法學(xué)考察。由表3可見,綠原酸、蘆丁、槲皮素3種對照品在質(zhì)量濃度為0.059~20.000 μg/mL線性關(guān)系良好。精密度試驗中,3種對照品的精密度RSD分別為1.92%、3.34%、1.47%。24 h 穩(wěn)定性試驗中,綠原酸、蘆丁、槲皮素的RSD分別為0.890%、0.826%、2.520%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗中RSD分別為1.18%、0.75%、2.10%,表明方法重復(fù)性良好。高、中、低不同濃度的平均回收率為89%~103%,RSD均小于2%符合相關(guān)要求。

      2.3.3 樣品含量測定。按照“1.3.3.5”操作,結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過HPLC法確定純化后的藥桑提取物中含有綠原酸、蘆丁、槲皮素3種成分(圖7),其含量分別為1.36、2.54、0.01 μg/mg。

      3 討論

      新疆藥桑為特色藥材,在南疆地區(qū)廣有種植,但由于其成熟期較短往往造成大面積的資源浪費,目前市場上也鮮有相關(guān)產(chǎn)品。為了更好地開發(fā)利用這一特色藥食兩用資源,在前期的基礎(chǔ)性研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出藥桑抗糖尿病的多靶標(biāo)及活性成分,初步發(fā)現(xiàn),藥桑中的槲皮素、白藜蘆醇、桑色素等可能是藥桑發(fā)揮抗糖尿病作用的主要成分,這些都屬于黃酮類成分[8]。有報道認(rèn)為,藥桑黃酮不僅具有良好的抗氧化活性,而且對糖尿病大鼠具有較好的降血糖、降血脂作用[9]。進(jìn)一步的作用靶點研究發(fā)現(xiàn),活性成分的高頻作用靶點可能與氮代謝、半乳糖代謝、PI3K-Akt信號通路等密切相關(guān),這些作用通路可能是藥桑發(fā)揮多組分協(xié)同防治糖尿病的活性依據(jù)。為了更加深入地研究藥桑黃酮抗糖尿病的作用機制,有必要對其黃酮類藥效物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

      大孔樹脂是目前工業(yè)上富集、純化黃酮和皂苷類最為常用的高分子化合物[10-12]。該試驗選擇5種不同型號與類型的大孔樹脂,通過靜態(tài)吸附-解吸試驗,利用紫外的NaNO2法對藥桑中黃酮含量進(jìn)行測定,比較確定AB-8型大孔樹脂作為純化藥桑總黃酮的最優(yōu)樹脂。進(jìn)一步通過因素考察確定了最佳純化工藝:藥液濃度約為0.208 mg/mL、pH為4、上樣液流速1.5 mL/min,再用70%乙醇溶液40 mL進(jìn)行洗脫,非常適用于藥??傸S酮的工業(yè)化制備。

      該試驗考慮僅僅以紫外法作為總黃酮含量的測定方法不夠準(zhǔn)確,因為藥??傸S酮中的主要成分除了蘆丁外,還含有綠原酸、槲皮素、白藜蘆醇、桑色素等[13-14],傳統(tǒng)的紫外方法只以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定,方法并不能直接體現(xiàn)出活性成分的含量變化,HPLC法可以對黃酮類中的具體物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確地定量測定,因此試驗進(jìn)一步利用HPLC法確定藥桑中含有綠原酸、蘆丁、槲皮素,并定量得到純化后藥桑提取物中綠原酸、蘆丁、槲皮素的含量分別為1.36、2.54、0.01 μg/mg。方法學(xué)驗證證明可以用此方法對黃酮類物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控,從而得到純度和含量均較高的黃酮物質(zhì)。

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