復(fù)合乳酸菌制劑的耐受性和抑菌性研究

辛 娜，郭 亮，鄧露芳，郭上銘，孫林芳，張 勇，王光晴

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京101105）

抗生素在提高養(yǎng)殖效益、保證動(dòng)物健康乃至促進(jìn)畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展方面發(fā)揮了非常重要的作用，但是由于長(zhǎng)時(shí)間對(duì)抗生素過度依賴和濫用，其弊端日益顯現(xiàn)，如破壞消化道微生物穩(wěn)態(tài)、提高細(xì)菌病原體抗生素耐受性、降低機(jī)體免疫力等（Li等，2013；楊波，2007)，探尋抗生素替代品已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。益生菌因其具有無毒、無殘留、無抗藥性等特點(diǎn)在眾多抗生素替代品中脫穎而出。乳酸菌作為使用最早、應(yīng)用最廣泛的益生菌之一，其能夠調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的平衡，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力和免疫力，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能及飼料轉(zhuǎn)化率（楊玲，2014）。近年來，大量學(xué)者從乳酸菌株的耐酸和膽鹽及對(duì)胃腸道的耐受性、抗病原菌的活性、抗生素耐受性、安全性等方面進(jìn)行體外評(píng)價(jià)（劉明珠，2013；Collado 等，2006）。

本試驗(yàn)將四株乳酸菌制成復(fù)合乳酸菌制劑，在實(shí)驗(yàn)室條件下研究其對(duì)溫度 （水浴模擬制粒）、不同pH、膽鹽、常用飼料抗生素的耐受性及對(duì)致病菌的抑制作用，以期為乳酸菌制劑在飼料及動(dòng)物上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 乳酸菌株H1、H4、H5、H6為北京綠荷康牧生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。經(jīng)生理生化反應(yīng)及16sRNA結(jié)合鑒定為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、屎腸球菌。

1.1.2 試劑 磷酸鹽緩沖液、禽膽鹽、牛膽鹽、豬膽鹽。

1.1.3 抗生素 20%土霉素、15%金霉素、50%吉他霉素、10%桿菌肽鋅、15%亞甲基水楊酸桿菌肽、20%莫能菌素、12%鹽霉素、4%黃霉素，均為市售產(chǎn)品，由北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司提供。

1.1.4 指示菌 大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌 （ATCC25923）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.1.5 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、MRSbroth、MRS agar、M-H瓊脂購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.6 復(fù)合乳酸菌制劑 復(fù)合乳酸菌制劑由四株乳酸菌復(fù)合發(fā)酵復(fù)配而成，為北京綠荷康牧生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 耐溫試驗(yàn) 參照張璐（2008）方法，100 g基礎(chǔ)日糧裝于試劑瓶中，封口。121℃滅菌30 min，冷卻后按照0.1%的添加量將復(fù)合乳酸菌制劑與基礎(chǔ)日糧混合均勻后，飼料水分控制在17%～18%。用水浴模擬制粒溫度，取1 g于滅菌三角瓶中，分別置于 65、85 ℃水浴中作用 2.5、5、7.5 min，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。水浴結(jié)束后立即置于冷水中進(jìn)行冷卻。進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，取1 mL樣液至培養(yǎng)皿中。將冷卻至45～55℃的MRS培養(yǎng)基傾注于每個(gè)平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，37℃倒置培養(yǎng)2 d。計(jì)算存活率：

存活率/%=處理后活菌數(shù)/未處理活菌數(shù)×100。

1.2.2 耐酸試驗(yàn) 將磷酸鹽緩沖液分裝至250 mL的試劑瓶中，每瓶分裝90 mL稀釋液。用1 mol/L的 NaOH 和 HCl將稀釋液的 pH 調(diào)至 2、3、4、5、6，空白對(duì)照組pH為6.8，將稀釋液高壓滅菌30 min。稱取復(fù)合乳酸菌制劑10 g至各pH的試劑瓶中。37℃水浴處理30、60、90 min，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋倍數(shù)，取1 mL至培養(yǎng)皿中。及時(shí)將冷卻至45～55℃的MRS培養(yǎng)基傾注于每個(gè)平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。待瓊脂凝固后，37℃倒置培養(yǎng)2 d。計(jì)算存活率。

1.2.3 耐膽鹽試驗(yàn) 取10 g復(fù)合乳酸菌制劑分別加入0、0.3%的膽鹽（豬膽鹽、禽膽鹽、牛膽鹽）溶液90 mL，混勻于37℃水浴中分別處理1、2、3 h，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋倍數(shù)，取1 mL至培養(yǎng)皿中。及時(shí)將冷卻為45～55℃的MRS培養(yǎng)基傾注于每個(gè)平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。待瓊脂凝固后，37℃倒置培養(yǎng)2 d。計(jì)算存活率。

1.2.4 耐抗生素試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)室采用胡生梅等（2015）瓊脂稀釋法測(cè)定復(fù)合乳酸菌對(duì)藥物飼料添加劑的最低抑菌濃度（MIC）。將藥物飼料添加劑分別用相應(yīng)溶劑溶解后，再用滅菌蒸餾水成比例稀釋成所需濃度。將抗生素加入滅菌并冷卻至50℃左右的M-H瓊脂中，充分振蕩，使抗生素與培養(yǎng)基混合均勻。（用培養(yǎng)基將抗生素稀釋20倍）。將混有抗生素的培養(yǎng)基傾倒入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿標(biāo)記抗生素種類及稀釋后濃度。每一濃度做兩個(gè)平皿，即平行樣。待培養(yǎng)基凝固后，取活化培養(yǎng)18 h的復(fù)合乳酸菌制劑 （約0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?0 mL加入90 mL滅菌稀釋液中，混勻，梯度為10-1。取稀釋度10-1菌液100 μL置于平板上，進(jìn)行平板涂抹。37℃，倒置培養(yǎng)。結(jié)果以完全抑制菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。各抗生素配制濃度梯度見表1。

表1 不同抗生素的配制濃度

1.2.5 對(duì)致病菌的抑制試驗(yàn) 參照劉冬梅等（2006）牛津杯擴(kuò)散法。取滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂，待溫度降至50℃左右時(shí)倒平板，每個(gè)平皿約15 mL。待瓊脂凝固后，用滅菌的鑷子夾牛津杯置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中。每個(gè)平板放置4個(gè)牛津杯。分別取大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌0.1 mL（108cfu/mL）加入到已滅菌100 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂中（冷卻至50℃左右），搖勻后傾倒，注意不要起泡。待瓊脂凝固后，用鑷子將牛津杯夾出來，將孔進(jìn)行標(biāo)記（牛津杯外徑 8 mm），標(biāo)記為 1、2、3、4。 孔 1 中加入滅菌MRS液體培養(yǎng)基100 μL作對(duì)照，取活化培養(yǎng)18 h的復(fù)合乳酸菌制劑稀釋液100 μL，加入2、3、4孔中，3個(gè)重復(fù)。置于4℃冰箱放置1 h后，置于37℃培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)復(fù)合乳酸菌制劑的影響 從表2可見，隨著處理溫度及處理時(shí)間的增加，乳酸菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。 65℃處理 2.5、5、7.5 min，85 ℃處理2.5 min存活率均在96%以上。85℃處理復(fù)合乳酸菌制劑5、7.5 min，存活率下降至47.92%、29.84%。

2.2 不同pH對(duì)復(fù)合乳酸菌制劑的影響 從表3可以看出，在 pH為2時(shí)活菌數(shù)受到影響較為嚴(yán)重，處理90 min存活率為59.46%。隨著pH的增加，復(fù)合乳酸菌的存活率呈增加趨勢(shì)。處理90 min，pH為3時(shí)存活率高達(dá)80.54%，pH為4、5、6時(shí)存活率均在 90%以上。且在 pH為 3、4時(shí)，處理90 min的存活率較處理60 min均略有提高?？傮w來說，復(fù)合乳酸菌制劑在弱酸性環(huán)境下，存活率較高。

表2 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)不同溫度處理的存活率%%%%

表3 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)不同pH處理的存活率%

2.3 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)0.3%膽鹽耐受性試驗(yàn)從表4可以看出，隨著膽鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合乳酸菌制劑存活率明顯下降。復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)0.3%豬膽鹽的耐受性較好，對(duì)0.3%牛膽鹽耐受性較差，對(duì)0.3%禽膽鹽耐受性最差。0.3%豬膽鹽處理1 h，存活率為73.52%，處理2 h，存活率為60.63%。復(fù)合乳酸菌制劑可以更好耐受0.3%豬膽鹽，可以作為豬的飼料添加劑。

表4 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)0.3%膽鹽（不同種類）的存活率%

2.4 復(fù)合乳酸菌制劑耐抗生素試驗(yàn) 從表5可知，復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)8種藥物飼料添加劑有不同程度的耐受性，其中對(duì)桿菌肽鋅、亞甲基水楊酸桿菌肽的耐受性最強(qiáng)，最小抑菌濃度（MIC）大于1280 mg/kg。其次是黃霉素，以下依次是土霉素鈣、莫能菌素、鹽霉素、金霉素。復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)這些抗生素的耐受濃度均超過國(guó)家規(guī)定添加劑量，在添加這些藥物飼料添加劑的飼料中，可以使用復(fù)合乳酸菌制劑。其對(duì)吉他霉素的耐受性最差，低于國(guó)家規(guī)定配合飼料的最大添加量。因此，在添加吉他霉素的配合飼料中，使用復(fù)合乳酸菌制劑可能沒有效果。

2.5 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)致病菌的抑制作用試驗(yàn)從表6可知，復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)大腸埃希氏菌有抑制作用，抑制圈直徑為10.2 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌沒有抑菌作用。

表5 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)抗生素的耐受性

表6 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)致病菌的抑制作用

3 討論

飼用乳酸菌發(fā)揮益生作用，首先要有一定的活菌數(shù)，在進(jìn)入動(dòng)物胃腸道時(shí)，能夠耐受胃腸道環(huán)境，抑制病原菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，在飼料加工過程中，能夠耐受高溫制粒、耐受飼料藥物添加劑 （李舒寧，2014；龔慧，2014）。

3.1 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)溫度的耐受性 益生菌在飼料制粒和膨化過程中，都會(huì)經(jīng)過高溫高壓處理。顆粒飼料蒸汽調(diào)質(zhì)時(shí)間一般為30 s～2 min，溫度一般為60～80℃（韓慶功等，2018；單春?jiǎn)蹋?017），所以，乳酸菌的耐溫考察非常有必要。不同微生物對(duì)熱有不同的耐受能力，這與菌齡、菌種、基質(zhì)pH等有關(guān)。一般革蘭氏陽性菌大于陰性菌，嗜熱菌大于嗜溫菌和嗜冷菌，菌體細(xì)胞處于穩(wěn)定期大于對(duì)數(shù)期，基質(zhì)pH為7左右，菌抗熱能力最強(qiáng)。乳桿菌屬、微球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬的部分菌株都有一定的耐熱能力（張宜鳳，2008）。劉超齊等（2016）報(bào)道，干酪乳桿菌不耐受50℃及超過50℃高溫，乳酸鏈球菌能耐受60℃，其存活率為96%。韓慶功等（2018）試驗(yàn)表明，植物乳桿菌在溫度70℃條件下處理2 min，存活率可以達(dá)到88.9%，但當(dāng)溫度升高到80℃時(shí)處理2 min，存活率則下降至34.95%。本試驗(yàn)65℃處理2.5、5 min及7.5 min，85℃處理2.5 min存活率均在96%以上，對(duì)存活率幾乎沒有影響。85℃處理復(fù)合乳酸菌制劑 5、7.5 min，存活率下降至 47.92%、29.84%，復(fù)合乳酸菌制劑能較好的耐受高溫主要與固體飼料導(dǎo)熱性差，乳桿菌屬、腸球菌屬具有一定的耐熱能力及配方中有保護(hù)劑有關(guān)。

3.2 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)pH、膽鹽的耐受性 仔豬出生時(shí)胃內(nèi)pH為5～6，數(shù)小時(shí)后pH降至4左右，2月齡前胃內(nèi)pH保持在3左右，食物在胃內(nèi)的消化時(shí)間相對(duì)較短，一般為1～2 h（吳慧芬等，2005；凌代文，1993）。研究表明，不同乳酸菌菌株對(duì)不同pH的耐受性不同。顧瑞霞等（1996）報(bào)道嗜酸乳桿菌在37℃，20 min后，活菌數(shù)迅速下降，嬰兒雙歧桿菌在pH為2時(shí)，37℃處理1 h，活菌數(shù)基本不變。單春?jiǎn)痰龋?017）研究表明，飼用屎腸球菌M74在pH為3的條件下，保持3 h后，存活率為11.57%。王彥萍等（2016）研究飼用乳酸菌NCU156在pH為2.5的MRS培養(yǎng)基中，作用4 h存活率為 87.31%。本試驗(yàn)在 pH為2時(shí)活菌數(shù)受到影響較為嚴(yán)重，但隨著pH的增加，復(fù)合乳酸菌的存活率呈增加趨勢(shì)，主要是因?yàn)閜H過低時(shí)，乳酸菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，通透性、滲透壓等增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂。在pH為3、4時(shí)，處理90 min的存活率均較處理60 min略有提高，說明其能通過自身的應(yīng)急反應(yīng)來抵抗脅迫所造成的危害?？傮w來說，復(fù)合乳酸菌制劑在酸性環(huán)境下，存活率較高。

豬消化道中的膽鹽含量為0.03%～0.3%。十二指腸中的膽汁酸鹽對(duì)外源細(xì)菌具有抑制作用，細(xì)菌在腸道的存活和增殖，必須能夠耐受0.3%膽鹽的環(huán)境（Wasson 等，2000；Hyronimus等，2000），通常0.3%膽鹽濃度被認(rèn)為是篩選抗性菌 （益生菌）的標(biāo)準(zhǔn)（Gilliland 等，1984）。 研究表明，乳酸菌能夠耐受一定濃度的膽鹽，對(duì)致病菌有不同程度的抑制作用（董曉麗等，2012）。本試驗(yàn)采用0.3%作為菌株耐膽鹽性能測(cè)定的濃度，0.3%豬膽鹽處理1 h存活率為73.52%，2 h存活率為60.63%，表明復(fù)合乳酸菌制劑能夠很好的耐受0.3%豬膽鹽。

3.3 復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)抗生素及致病菌的抑制作用 益生菌制劑要想部分替代抗生素必須要考慮抗生素和益生菌是否存在協(xié)同作用，即益生菌對(duì)抗生素的耐受性。不同菌株對(duì)不同抗生素的耐受性也不盡相同。劉明珠（2013）研究表明，乳酸糞腸球菌對(duì)阿散酸、桿菌肽鋅、金霉素、喹乙醇、硫酸黏桿菌等5種藥物有較強(qiáng)的耐受作用，對(duì)吉他霉素、鹽霉素的耐受性相對(duì)較差。孫笑非（2009）研究得出，芽孢桿菌對(duì)吉他霉素、喹乙醇、金霉素、黃霉素、桿菌肽鋅、鹽霉素、阿散酸、維吉尼亞霉素、硫酸黏桿菌素的耐受性均超過國(guó)家規(guī)定添加劑量。本研究中，除吉他霉素外，復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)其他幾種抗生素的耐受濃度均超過國(guó)家規(guī)定添加劑量。在實(shí)際應(yīng)用中，在含有上述7種抗生素 （除吉他霉素）的飼料中添加復(fù)合乳酸菌制劑，不會(huì)影響乳酸菌數(shù)。若吉他霉素與乳酸菌制劑配合應(yīng)用，可通過增加益生菌用量或者減少抗生素用量來實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，其對(duì)大腸埃希氏菌有抑制作用。乳酸菌制劑抑制有害菌主要是因?yàn)槿樗峋捌浯x產(chǎn)物中富含乙酸、乳酸等有機(jī)酸，以及細(xì)菌素和過氧化氫等各種抑菌成分（Zhang等，2007）。 羅睿（2011）試驗(yàn)表明，極端的酸性環(huán)境能夠在一定程度上抑制病原微生物的生長(zhǎng)，但酸度不是抑菌的唯一因素，其與代謝產(chǎn)物協(xié)同作用才能真正達(dá)到抑菌效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)0.3%豬膽鹽、酸性環(huán)境、高溫具有很好的耐受性，對(duì)病原菌大腸埃希氏菌有抑制作用，能夠耐受除吉他霉素外的其他7種抗生素。因此，可進(jìn)一步研究其作為微生物添加劑對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響。