嚴(yán)春霞，陸偉宏，何國產(chǎn)，聞人慶，錢 穎

1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，浙江金華 3210072金華市人民醫(yī)院兒科，浙江金華 321000

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是引起原發(fā)性非典型肺炎等呼吸道感染性疾病的常見病原體，通過呼吸道傳播，并以嬰幼兒多見。支原體肺炎的臨床表現(xiàn)不典型，與其他常見呼吸道疾病所致的感染非常相似，僅憑臨床癥狀、病原學(xué)診斷，往往難以做出準(zhǔn)確的早期診斷[1]。有資料顯示肺炎支原體易發(fā)生混合感染或者和其他疾病共同存在，臨床表現(xiàn)更加不典型，易漏診，延誤病情[2]。因此，為了早期診斷、及時治療支原體肺炎，快速準(zhǔn)確的診斷方法顯得頗為重要。Mp的實(shí)驗室檢查中血清學(xué)檢測依然是目前臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查的主要手段，但檢測結(jié)果受患兒年齡、病程、機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響[3- 6]，因此只做單份血清抗體檢測只能作為感染的輔助診斷。PCR具有很高的敏感性，比血清抗體能更早地檢測出Mp[7]，但是操作復(fù)雜、成本高、需要的時間長并需昂貴儀器，不適合各醫(yī)院開展。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi等[8]開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63 ℃左右)保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。采用肺炎支原體一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒[9- 10]檢測金華市人民醫(yī)院2016年4月至2018年3月在入院的第1天采集到的108例住院患者的Mp-DNA標(biāo)本，同時以PCR法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測同一患者標(biāo)本，作為對照。以PCR法作為診斷肺炎支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，比較該檢測方法對Mp感染的臨床診斷價值。

材料和方法

材料來源MpPCR檢測試劑盒(熒光法)購于上海之江生物科技股份有限公司；Mp-Ab ELISA試劑盒購于杭州艾康生物技術(shù)有限公司；引物由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司合成；其他生化試劑購于Sigma公司。

標(biāo)本來源隨機(jī)選取2016年4月至2018年3月金華市人民醫(yī)院兒科住院患兒咽拭子標(biāo)本和血清標(biāo)本108例，均在入院的第1和5天收集樣本。年齡為6個月～12歲；病程為≤3周；無哮喘、先天性或慢性肺部疾病，其中病例組73例，符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCR法檢測結(jié)果陽性被診斷為患兒；對照組35例，取自臨床和PCR法排除兒童支原體肺炎的其他慢、急性呼吸道感染者。在入院的第1天取2份咽拭子標(biāo)本和1份血清標(biāo)本，入院的第5天盡量取2份咽拭子標(biāo)本和1份血清標(biāo)本(由于患兒采血困難，所以第2次血清標(biāo)本只收集到40份)。哺乳期嬰兒禁止吃奶2 h后取樣。一份咽拭子標(biāo)本用于MpPCR檢測；一份咽拭子標(biāo)本用于文獻(xiàn)[9- 10]研制的肺炎支原體一步法可視化等溫擴(kuò)增試劑盒檢測；血清標(biāo)本用于ELISA法(IgM抗體)檢測。

樣本處理兩份咽拭子標(biāo)本一份用于PCR法檢測，按說明書操作提取基因組DNA，4 ℃保存?zhèn)溆?；另一份咽拭子?biāo)本用于本研究設(shè)計的一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增實(shí)驗，將咽拭子加入到含1 ml TE緩沖液的無菌管中，充分混勻后吸取0.5 ml，加0.5 ml 2×一步法快速提取緩沖液(提取緩沖液為1% 十二烷基硫酸鈉，10 mmol/L Tris，0.3 mol/L乙二胺四乙酸，1%交聯(lián)聚乙烯吡絡(luò)烷酮，pH 8.0)，混勻后置于90 ℃水浴中，不時顛倒混勻。孵育20 min后，置于冰浴中5 min。4 ℃下保存，用于肺炎支原體一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增。血清標(biāo)本取樣后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)參數(shù)PCR法和ELISA法按產(chǎn)品說明書操作；可視化LAMP反應(yīng)參數(shù)為：外引物F3：CACCCTCGG-GGGCAGTCAG；外引物B3：GACCAGCAGGGACAATCAG；上游內(nèi)引物：FIP(F1C-F2)：ATGATTACAGGCGGTTCGTTTTGTTCAGAGCTGGAGGTTGGCT；下游內(nèi)引物：BIP(B1C-B2)：ACCACACCAAGTTCACGAGCGTT-TTTCATTCCTTCACCCCGCCC。反應(yīng)總體積為25.0 μl，包括2.5 μl 10×聚合酶反應(yīng)緩沖液；4.0 μl MgSO4(25 mmol/L)；1.0 μl dNTPs(15 mmol/L)；1.0 μl 鏈置換DNA 聚合酶(8 U/μl)；各1.0 μl F3、B3(5 μmol/L)；各1.0 μl 內(nèi)引物FIP、BIP(20 μmol/L)；1.5 μl 3 mmol/L 羥甲基萘酚藍(lán)；2.0 μl提取的Mp基因組DNA；ddH2O補(bǔ)足至25.0 μl，63 ℃反應(yīng)60 min觀察各管顏色變化，以十六烷基三甲基溴化銨法提取肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為陽性對照；以ddH2O為陰性對照。

結(jié)果判讀

MpPCR檢測(熒光法)判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照Ct值應(yīng)小于38，陰性對照Ct值無數(shù)據(jù)，否則該次實(shí)驗視為無效，應(yīng)檢查儀器、試劑、擴(kuò)增條件等方面的誤差。

檢測樣本Ct值≤38.0者判為陽性；檢測樣本Ct值>38.0的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值<40為陽性，否則為陰性。

MpELISA檢測結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：490 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。實(shí)驗成立的條件是：陽性對照孔0.6≤OD 490 值≤2.0，陰性對照孔 OD 490 值≤0.2。按下列公式計算標(biāo)本吸光度/陰性對照吸光度(specimen absorbance/negative control absorbance，S/N)：被檢血清 2 孔的平均 OD 490 值/陰性對照血清 2 孔的平均 OD 490 值。如果樣品 S/N ≥3，判為陽性；如果 S/N ≤2.5，判為陰性；S/N為 2.5 ～3為可疑，應(yīng)重測，重測后 S/N ≥3 判為陽性，S/N <3 判為陰性。

一步法肺炎支原體等溫擴(kuò)增判讀標(biāo)準(zhǔn)：63 ℃反應(yīng)60 min后變?yōu)樘焖{(lán)色的為陽性，紫色的為陰性。陰性對照為紫色，若陰性對照為藍(lán)色為無效，應(yīng)檢驗檢測體系，重測。

統(tǒng)計學(xué)處理計算Kappa統(tǒng)計量，評價兩種方法檢驗結(jié)果之間的一致性。Kappa值的判定：0.75～1.00 符合很好；0.40～0.74一般符合；0.01～0.39缺乏符合。

結(jié) 果

以熒光PCR法作為診斷肺炎支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，入院第1天采集的標(biāo)本經(jīng)3種檢測方法所得結(jié)果顯示，LAMP方法的敏感度為100%，特異度為94.3%，陽性預(yù)測值為97.3%，陰性預(yù)測值為100%，陽性似然比為17.5，陰性似然比為0，尤等指數(shù)為0.943；ELISA法的敏感度為65.8%，特異度為82.9%，陽性預(yù)測值為88.9%，陰性預(yù)測值為53.7%，陽性似然比為5.85，陰性似然比為0.41，尤等指數(shù)為0.487(表1)。一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增與PCR法結(jié)果比較，用一致性檢驗評價這兩種方法的一致程度，公式計算Kappa值為0.956，大于0.75，說明肺炎支原體一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增與PCR法的一致性好，兩者可以比較。肺炎支原體一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增與ELISA法結(jié)果比較顯示，用公式計算Kappa值為0.38，小于0.40，說明肺炎支原體一步法可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增與ELISA方法之間缺乏一致性，不可比較(表2)。

入院第5天與第1天3種方法檢測40位患者的結(jié)果顯示，第5天與第1天患者檢測結(jié)果相同例數(shù)最多的是LAMP法，最少的是ELISA法(表3)。

討 論

早期診斷支原體肺炎，對快速準(zhǔn)確治療有重要意義。目前，診斷支原體肺炎的方法主要有培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和PCR法。雖然Mp的實(shí)驗室檢測方法多樣，但是各種方法均有其優(yōu)勢與不足，目前國內(nèi)外Mp實(shí)驗室檢測也沒有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)法是診斷支原體肺炎的金標(biāo)準(zhǔn)，一旦培養(yǎng)出肺炎支原體即可確診，但是培養(yǎng)法操作復(fù)雜，受樣本來源、保存、運(yùn)輸方式、樣本中Mp含量以及實(shí)驗員技術(shù)水平等多種因素的影響，診斷Mp感染的靈敏度僅為60%[11]，對臨床早期診斷的意義不大，常用于回顧性診斷和研究。有研究比較了培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和PCR法在支原體肺炎中的差異，一致認(rèn)為培養(yǎng)法靈敏度、特異性和檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血清學(xué)方法和PCR法[12]。國內(nèi)資料顯示，ELISA法的敏感性為71%，要高于培養(yǎng)法，但又比LAMP法和PCR法敏感性低得多[12]。ELISA法最好用雙份血清，可以提高特異度和敏感度，但由于雙份血清比較難獲得，所以不適宜用作金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》應(yīng)選擇原理相同或接近的作為對照，因本研究采用的是核酸等溫擴(kuò)增原理，市面上尚無同類試劑，因此選擇原理接近的MpPCR檢測試劑盒作為對照。又因PCR法的敏感度和特異度都比較高，國外也有報道以PCR法為金標(biāo)準(zhǔn)[13]，PCR法的敏感度和特異度都比較高，故而本研究用PCR法作為診斷支原體肺炎的金標(biāo)準(zhǔn)。

表1 入院第1天采集的標(biāo)本經(jīng)3種檢測方法檢測結(jié)果的比較(n)Table 1 Results of three detection methods for clinical specimens obtained on the first day of admission(n)

PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗

PCR：polymerase chain reaction；LAMP：loop-mediated isothermal amplification；ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay

表2 LAMP法與ELISA法檢測結(jié)果的比較(n)Table 2 Comparisons of the results of LAMP and ELISA(n)

本研究LAMP法的敏感度為100%，特異度為94.3%，與日本研發(fā)的LAMP試劑盒檢測的結(jié)果基本相符[14- 15]。表1是患者入院第1天檢查結(jié)果，這個結(jié)果顯示，ELISA法對早期肺炎支原體診斷的敏感性較低，而LAMP法在早期的診斷上有比較明顯的優(yōu)勢。LAMP法與PCR法、ELISA法的比較，證實(shí)了LAMP法與PCR法具有可比性，與ELISA法差異明顯，不具有可比性。LAMP技術(shù)可用于支原體肺炎的早期診斷。

本研究顯示用ELISA法第5天為陽性、第1天為陰性的有6例，這可能是因為IgM抗體是在肺炎支原體感染后1周才能出現(xiàn)有關(guān)，估計是這6例患者感染的時間太短無法檢測出來導(dǎo)致的。第5天為陰性、第1天為陽性的病例有4例，根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道，血清特異性抗體 IgM 一般出現(xiàn)于Mp感染后 7 ～ 14 d，3 ～ 4 周達(dá)高峰，可持續(xù)數(shù)月不等[16- 17]，這就無法解釋本研究的結(jié)果，但實(shí)際上IgM抗體的半衰期很短，僅有5 d，它反映的是近期感染。

用PCR法檢測第5天為陽性、第1天為陰性的有3例，這可能和樣本的采集不當(dāng)、取樣部位太淺有關(guān)[18]。第5天為陰性、第1天為陽性的病例有4例，這可能是這幾例患者的癥狀比較典型，用抗生素的時間較早，縮短了MpDNA存在的時間，這個結(jié)果也符合Kakuya等[14]的猜測。

用LAMP法檢測第5天為陽性、第1天為陰性的有2例，這可能和樣本的采集不當(dāng)有關(guān)，或者是在感染的第1、2天，還沒辦法檢測到MpDNA有關(guān)。第5天為陰性、第1天為陽性的病例有4例，推測這個原因和PCR法的相同，表明患者得到了及時的治療，病情已好，所以才檢測不到MpDNA。

ELISA檢測MpIgM抗體，IgM是機(jī)體受肺炎支原體感染時出現(xiàn)的特異性抗體，一般在感染后1周出現(xiàn)，因此，檢測結(jié)果中ELISA法的假陰性結(jié)果偏高。故此法檢測的陰性結(jié)果不能排除肺炎支原體感染。ELISA法最好在肺炎支原體感染后1周內(nèi)進(jìn)行檢測或者進(jìn)行2次檢測，以提高檢出率，避免漏診。但雙份血清的獲得比較困難。本研究顯示血清學(xué)方法受患兒病程影響較大，特別是對肺炎支原體的早期診斷敏感性較低，不利于患者早期的正確治療。LAMP法和PCR法檢測MpDNA，具有快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，同時可避免患兒年齡、病程和抗生素治療的影響，早期診斷支原體肺炎，特別是2歲以下患兒更適合用此法。和PCR法比較，LAMP法的操作更簡單，反應(yīng)時間短，結(jié)果判斷更直觀，對儀器設(shè)備、人員操作技能要求低，普通實(shí)驗室即可開展，特別適合現(xiàn)場高通量檢測和基層醫(yī)療組織開展檢測。

表3 3種方法檢測入院第5天與第1天40例患者的結(jié)果比較(n)Table 3 Results of 40 patients tested by three methods on the fifth day and the first day(n)

由于LAMP法具有敏感、特異、快速的特點(diǎn)，因此它對提高臨床檢測效率，靈敏、快速地鑒定臨床支原體肺炎有重要意義，對肺炎支原體感染的早期診治、防治并發(fā)癥和患者預(yù)后評估也有重要價值。綜上，本研究顯示LAMP法與PCR法比較，兩種方法的檢測結(jié)果符合率高，方法一致性好，LAMP法操作簡便，成本低，準(zhǔn)確性高，可以代替上述兩種方法在臨床上使用。