段娟娟，張啟芳，黃宗華，曾紅梅，柏 華，5，6

1貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州都勻 5580002貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 5500043貴州醫(yī)科大學(xué)教育部地方和少數(shù)民族疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 5500044貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州都勻 5580005貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽(yáng) 5500046貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，貴州都勻 558000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種老年人常見(jiàn)的癡呆類疾病，β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)與AD的發(fā)病關(guān)系密切[1]；Aβ有可能通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding domain and leucine-rich-repeat-containing family and pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小體，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)性炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)AD的發(fā)生和發(fā)展[2]。 BV2 細(xì)胞具備原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、表型以及各項(xiàng)功能特點(diǎn)，它是應(yīng)用攜帶癌基因 v-myc 的反轉(zhuǎn)錄病毒J2 感染原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞而獲得的永生細(xì)胞，用活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)劑過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo) BV2細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷模型能夠比較簡(jiǎn)潔和直觀地用于研究AD等神經(jīng)變性疾病[3]。組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)是一種存在于細(xì)胞溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶，它能催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解，細(xì)胞內(nèi)外多種刺激因素可以引起溶酶體膜的通透性變化，導(dǎo)致CTSB從溶酶體釋放進(jìn)入胞漿，參與激活細(xì)胞凋亡通路[4]。有研究顯示，CTSB活性與AD患者血液中的白細(xì)胞介素- 1β(interleukin- 1β，IL- 1β)和丙二醛水平呈正相關(guān)，但與AD患者血液中谷胱甘肽水平呈負(fù)相關(guān)，提示氧化應(yīng)激通過(guò)上調(diào)CTSB的活性激活NLRP3[5]。在實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌梗死模型中，CTSB的抑制劑環(huán)氧酶琥珀肽甲基酯[L- 3-trans-(propyl-carbamoyloxirane- 2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-proline methyl ester，CA- 074Me]通過(guò)NLRP3信號(hào)通路能夠促進(jìn)心肌重塑[6]。溶酶體破裂釋放的內(nèi)容物具有激活NLRP3炎癥小體的作用，其中有可能主要是CTSB在起作用；CTSB可能是通過(guò)降解NLRP3的抑制蛋白再激活NLRP3炎癥小體。另外，分布于溶酶體中的溶酶體離子通道蛋白-瞬時(shí)受體電位黏蛋白- 1(transient receptor potential mucolipin- 1，TRPML1)對(duì)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞自噬、胞吞作用及維持離子平衡具有重要的作用。TRPML1受pH值和鈣離子調(diào)節(jié)，并對(duì)鈣離子具有通透性[7]。推測(cè)在某些AD的發(fā)病過(guò)程中可能有CTSB的參與，CTSB是NLRP3炎癥小體活化的一種上游信號(hào)，這種活化需要TRPML1基因表達(dá)的增加和鈣離子信號(hào)的介導(dǎo)。本研究擬探討在細(xì)胞氧化應(yīng)激模型和特異性沉默TRPML1基因后的BV2細(xì)胞模型中，CTSB對(duì)NLRP3炎癥小體活化的影響以及TRPML1基因表達(dá)是否影響CTSB的變化。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)與分組小鼠BV2細(xì)胞(購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司)貼壁生長(zhǎng)在含12%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(加低濃度的青霉素和鏈霉素)，置入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4～6天傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分4組。第1組為PBS處理組，作為對(duì)照組，用PBS 5 ml孵育細(xì)胞20 min，隨后提取細(xì)胞的RNA或總蛋白，或者按實(shí)驗(yàn)要求繼續(xù)培養(yǎng)；第2組為H2O2處理組，單純用0.5 mmol/L H2O2孵育細(xì)胞20 min，然后提取細(xì)胞的RNA或總蛋白。第3組為H2O2+GdCl3組，先用0.5 mmol/L的H2O2處理細(xì)胞20min，再換成2 mmol/L的GdCl3處理細(xì)胞15 min，最后進(jìn)行細(xì)胞RNA或總蛋白的提??；第4組為H2O2+GdCl3+CA- 074Me組，先用5 μmol/L的CA-074Me預(yù)處理細(xì)胞10 min，接著加入0.5 mmol/L的H2O2共同處理細(xì)胞20 min，再換成2 mmol/L的GdCl3處理細(xì)胞15 min，最后進(jìn)行細(xì)胞RNA或總蛋白的提取。如果分析細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，則在上述處理結(jié)束后繼續(xù)換成1640培養(yǎng)基按需要的程序培養(yǎng)。各處理組均需要加用100 ng/ml濃度的脂多糖(Sigma，Cat#：L6529)進(jìn)行預(yù)處理2 h。

酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)細(xì)胞中的半胱天冬酶-1和IL- 1β蛋白檢測(cè)均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法，酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購(gòu)于上海嵐派生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。使用BIO-RAD- 680型酶標(biāo)儀，630/450 nm雙波長(zhǎng)測(cè)定光密度(optical density，OD)值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品濃度。每組檢測(cè)重復(fù)5次，取平均值。

MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力將BV2細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)各組試劑處理后，在培養(yǎng)基中加入1 g/L的噻唑藍(lán)，37 ℃溫育4 h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔和加藥孔；調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、DMSO；對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、DMSO。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔光密度，間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量，并作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、以紫外分光光度計(jì)所測(cè)得的OD值為縱坐標(biāo)做生長(zhǎng)曲線，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)細(xì)胞7次。

質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染從NCBI 基因庫(kù)中獲得小鼠TRPML1基因的全序列，注意下游附近的20余個(gè)核苷酸，去除與其他基因有高度同源性的序列，探測(cè)目標(biāo)序列為：5’-CCCACATCCAGGAGTGTAA- 3’ 。使用英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen)專有的BLOCK-iT RNAi方案設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)干擾片段短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)1、shRNA2 和一對(duì)無(wú)關(guān)序列片段，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司提供帶有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性篩選標(biāo)記的TRPML1基因沉默重組慢病毒顆粒慢病毒介導(dǎo)的帶有TRPML1的shRNA(LV-shRNA-TRPML1)及對(duì)照空載體慢病毒介導(dǎo)的帶有空載體的shRNA(LV-shRNA-NC)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，接種于6孔板中，1 ml/孔。按照LipofectamineTM- 2000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基加G418進(jìn)行抗性篩選；挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名為Tr-si-BV2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載體所獲得的細(xì)胞命名為si-Scr-BV2 細(xì)胞。BV2細(xì)胞(或si-Scr-BV2 細(xì)胞)和Tr-si-BV2細(xì)胞同時(shí)傳代生長(zhǎng)4～6 d后，提取總蛋白，再做蛋白免疫印跡檢測(cè)分析鑒別相關(guān)蛋白表達(dá)量。用TRPML1 siRNA或Scramble(Scr)RNA轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞60 h，再用0.3 mmol/L 的H2O2處理細(xì)胞3 h，用Western blot 檢測(cè)CTSB表達(dá)。

Western blot檢測(cè)NLRP3蛋白各組細(xì)胞達(dá)到處理時(shí)間后，將培養(yǎng)液吸棄，用預(yù)冷的PBS清洗1次，加入200 μl放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解液和苯甲基磺酰氟，放在冰面上裂解20 min，以12 000×g、4°C 離心10 min，吸取上清，BAC法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，先在80V電泳30 min，然后在120V電泳90 min，然后在250mA下電轉(zhuǎn)膜80 min。用含有脫脂奶粉的、混有聚山梨醇酯20的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(10 mmol/L Tris-HCI+0.15 mol/LNaCl+0.1% Tween- 20)封閉60 min。加入適當(dāng)稀釋的一抗：1∶500的兔抗鼠CTSB抗體、1∶400的兔抗鼠TRPML1抗體、1∶500的兔抗鼠轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)抗體、1∶1000的兔抗鼠微管蛋白抗體、1∶1000的兔抗鼠甘油醛- 3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白抗體、1∶400的兔抗鼠組織蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)抗體、1∶500的兔抗鼠組織蛋白酶L(cathepsin L，CTSL)抗體、1∶500的兔抗鼠組織蛋白酶V(cathepsin V，CTSV)抗體，以檢測(cè)上述相應(yīng)的蛋白。4°C過(guò)夜，再加入相應(yīng)的生物素化二抗，室溫放置120 min；然后加入ABC復(fù)合物、室溫放置30 min，再加入DAB顯色液。以微管蛋白(tubulin)作為內(nèi)對(duì)照，相同條件下重復(fù)3次。Western blot 檢測(cè)結(jié)果的條帶灰度用BIO-RAD公司的Quantity-One 分析軟件。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA分別收集上述各處理組細(xì)胞低溫保存?zhèn)溆?。采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒進(jìn)行標(biāo)本RNA的抽提，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)DNAMAN軟件進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)。NLRP3上游引物：5’-CCACAAGATCGYGAGAAAACCC- 3’，下游引物：5’-CGGTCCTATGTGCTCGTCA- 3’；TRPML1上游引物：5’-TCTTCCAGCACGGAGACAAC- 3’，下游引物：5’-AACTCGTTCTGC-AGCAGGAAGC- 3’。胱抑素C(cystatin C，Cys C)上游引物：5’-GATCGTAGCTG GGGTGAACT- 3’，下游引物：5’-CCTTTTCAGATGTGGCTGGT- 3’。β-actin上游引物：5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA- 3’，下游引物：5’-GTCGGAGATT-CGTAGCTGGA- 3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃，15 s變性、60 ℃ 1 min退火、60 ℃ 1 min延伸，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)約定公式計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS l6.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

NLRP3 mRNA的表達(dá)在BV2細(xì)胞各處理組中定量PCR結(jié)果顯示，PBS組、H2O2組、H2O2+GdCl3組、H2O2+GdCl3+CA- 074Me組的NLRP3 mRNA 相對(duì)含量分別為：3.24±0.45、5.45±0.78、5.96±0.81、3.19±0.38；PBS組與H2O2組或H2O2+GdCl3組比較，NLRP3 mRNA 相對(duì)含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.14，P=0.0012；t=8.79，P=0.0009)；H2O2組與H2O2+GdCl3+CA- 074Me組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 0.85，P=0.32)；H2O2+GdCl3組與H2O2+GdCl3+CA- 074Me組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 5.18，P=0.037)。其余各組兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

半胱天冬酶- 1和IL- 1β蛋白的變化情況ELISA檢測(cè)顯示，單純使用H2O2組或H2O2+GdCl3處理組與PBS組(僅用PBS處理)比較，半胱天冬酶-1明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.24，P=0.031)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與 H2O2+GdCl3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.68，P=0.021)。H2O2+GdCl3組與PBS組比較，BV2細(xì)胞中IL- 1β蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.70，P=0.0036)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與 H2O2+GdCl3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.08，P=0.036)；單純H2O2處理組與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.48，P>0.05)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與PBS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.79，P>0.05)(表1)。

表1 BV2細(xì)胞中不同處理組半胱天冬酶- 1和白細(xì)胞介素- 1β的比較(-±s)Table 1 Levels of caspase- 1 and interleukin- 1β in BV2 cell from four groups(-±s)

與PBS組比較，aP<0.05，bP<0.01；與H2O2+GdCl3組比較，cP<0.05

aP<0.05，bP<0.01 compared with PBS group；cP<0.05 compared with H2O2+GdCl3group

細(xì)胞生長(zhǎng)活力選擇BV2細(xì)胞的4組處理細(xì)胞分析細(xì)胞生長(zhǎng)活力，各組細(xì)胞在進(jìn)行相應(yīng)處理后，再轉(zhuǎn)換成1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力，用MTT法間接進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，各組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)12次(有4個(gè)復(fù)孔并重復(fù)3次)，取平均值，并作圖比較，結(jié)果顯示H2O2+GdCl3組生長(zhǎng)最慢，H2O2組生長(zhǎng)較慢，H2O2+GdCl3+CA- 074Me組的細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)較快(圖1)。組間方差分析顯示H2O2+GdCl3組與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.13，P=0.0065)，H2O2組與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.27，P=0.026)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.45，P>0.05)。

ROS影響溶酶體鈣離子通道蛋白TRPML1和組織蛋白酶B的表達(dá)用不同濃度的H2O2處理BV2細(xì)胞6 h，分別用定量PCR方法檢測(cè)TRPML1和Cys C的mRNA，用 Western blot方法檢測(cè)TRPML1、CTSB、CTSD、CTSL、CTSV蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示CTSB與TRPML1蛋白均有相似或同步的變化；200 μmol/L處理組與對(duì)照組比較，TRPML1 mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.54，P=0.006)；TRPML1蛋白表達(dá)相互之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.69，P=0.0055)。 200 μmol/L處理組與對(duì)照組比較，CTSB蛋白表達(dá)相互之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.34，P=0.004)。而50 μmol/L處理組或100 μmol/L處理組與對(duì)照組比較，同一蛋白或mRNA(CTSB或TRPML1)之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用定量PCR方法檢測(cè)Cys C mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示各處理組與對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTSD、CTSL、CTSV各處理組與PBS組或同一蛋白酶各組之間蛋白表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1MTT法檢測(cè)BV2細(xì)胞不同處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Fig1The cell growth curve of BV2 cells in different treatment groups(MTT method)

沉默TRPML1基因表達(dá)后對(duì)H2O2誘導(dǎo)的CTSB表達(dá)的影響采用Western blot 檢測(cè)已經(jīng)轉(zhuǎn)染和進(jìn)行了TRPML1基因沉默處理的BV2細(xì)胞(Tr-si-BV2)中TRPML1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示siRNA干擾組的TRPML1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(siScr組)；TRPML1蛋白表達(dá)與內(nèi)參GAPDH蛋白比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.04，P=0.0043)(圖3A)。針對(duì)Tr-si-BV2細(xì)胞進(jìn)行了CTSB蛋白表達(dá)的檢測(cè)，Western blot分析顯示H2O2處理組或H2O2+siScr處理組分別與PBS組比較，CTSB蛋白的表達(dá)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.85，P=0.0018；t=7.65，P=0.002)。H2O2+siRNA處理組與H2O2處理組比較，CTSB蛋白的表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.40，P=0.021)(圖3B)。轉(zhuǎn)錄因子EB蛋白的表達(dá)顯示，H2O2組(t=7.12，P=0.0001)、H2O2+TRPML1 siScr 組(t=6.95，P=0.0043)、H2O2+TRPML1 siRNA 組(t=3.17，P=0.026)與PBS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

NLRP3炎癥小體的激活與許多慢性炎癥和免疫異常相關(guān)疾病的發(fā)生相關(guān)。NLRP3是人類固有免疫中的重要模式識(shí)別受體，NLRP3與下游的接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白和效應(yīng)蛋白半胱天冬酶一起組裝形成NLRP3炎癥小體，這一炎癥小體對(duì)內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)和外源微生物有應(yīng)激感受作用[8]。通常認(rèn)為 NLRP3炎癥小體激活的始動(dòng)因素有各種病理晶體和相關(guān)病毒，參與NLRP3炎癥小體激活的機(jī)制涉及到線粒體損傷、活性氧激活、鉀離子外流、溶酶體破裂、鈣信號(hào)傳輸?shù)榷喾N因素[9]。β淀粉樣蛋白通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3炎癥小體，能夠?qū)е麓竽X內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元變性和死亡，從而誘發(fā)AD[10]；CTSB通過(guò)與NLRP3上的亮氨酸富含重復(fù)區(qū)域結(jié)合以降解NLRP3的抑制蛋白，從而促進(jìn)NLRP3與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白和半胱天冬酶- 1的結(jié)合，并參與激活細(xì)胞凋亡相關(guān)通路[11]。本研究以CTSB作為切入點(diǎn)探索NLRP3炎癥小體激活的新路徑，并進(jìn)一步追蹤介導(dǎo)CTSB作用的信號(hào)蛋白。

小膠質(zhì)細(xì)胞在AD的發(fā)病過(guò)程中既有可能被激活聚集到老年斑周圍，試圖吞噬Aβ 以抑制AD進(jìn)展；也有可能分泌一些炎癥性細(xì)胞因子，促進(jìn)免疫性神經(jīng)炎癥反應(yīng)和AD發(fā)病[12]。BV2細(xì)胞屬于一種永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞，本研究處理分組首先考慮到需要用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)BV2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，接著考慮用鈣敏感性受體激動(dòng)劑GdCl3是否能夠強(qiáng)化這種氧化應(yīng)激反應(yīng)，然后再加用CTSB抑制劑CA- 074Me觀察是否能夠部分阻滯上述氧化應(yīng)激反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理使用脂多糖，是考慮到脂多糖能夠誘導(dǎo)NLRP3蛋白或IL- 1β前體蛋白的表達(dá)增加，對(duì)活化NLRP3炎癥小體有重要的輔助作用；實(shí)驗(yàn)完成后發(fā)現(xiàn)與預(yù)期的效果比較一致。關(guān)于NLRP3 mRNA的表達(dá)，本研究使用實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在BV2細(xì)胞中H2O2組或H2O2+GdCl3組均比PBS組明顯增加，與國(guó)際同行的類似實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4]基本一致。由于NLRP3炎癥小體的活化不單純是NLRP3的高表達(dá)，還涉及一些下游信號(hào)分子的活化或高表達(dá)[13]，本研究用ELISA方法檢測(cè)了BV2細(xì)胞中 半胱天冬酶- 1和IL- 1β蛋白的變化情況，結(jié)果顯示在BV2細(xì)胞中的H2O2組或H2O2+GdCl3組半胱天冬酶- 1蛋白的表達(dá)均比對(duì)照組明顯增加；而在BV2細(xì)胞中的H2O2+GdCl3組的IL- 1β蛋白表達(dá)比對(duì)照組明顯增加，H2O2組的IL- 1β蛋白表達(dá)比對(duì)照組無(wú)增加，提示在不同的BV2細(xì)胞中部分下游分子活化的時(shí)間可能有所滯后。

TRPML1：瞬時(shí)受體電位黏蛋白- 1；CTSB：組織蛋白酶B；CTSD：組織蛋白酶D；CTSL：組織蛋白酶L；CTSV：組織蛋白酶V：Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；與0 μmol/L H2O2組比較，aP<0.05，bP<0.01

TRPML1：transient receptor potential mucolipin- 1；CTSB：cathepsin B；CTSD：cathepsin D；CTSL：cathepsin L；CTSV：cathepsin V；Mr：relative molecular mass；aP<0.05，bP<0.01 compared with 0 μmol/L H2O2group

A.BV2 細(xì)胞用不同濃度H2O2處理6 h胱抑素C mRNA 水平；B.BV2 細(xì)胞用不同濃度H2O2處理6 h，TRPML1 mRNA水平；C.BV2 細(xì)胞用不同濃度H2O2處理6 h，TRPML1、CTSB、CTSD、CTSL、CTSV蛋白表達(dá)

A.cystatin C mRNA level in BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours；B.TRPML1 mRNA levels of BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours；C.protein expressions of TRPML1，CTSB，CTSD，CTSL and CTSV in BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours

圖2過(guò)氧化氫作用于BV2細(xì)胞后對(duì)TRPML1蛋白和多種組織蛋白酶的影響

Fig2Effects of hydrogen peroxide on TRPML1 protein and various cathepsins in BV2 cells

CTSB通過(guò)Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路抑制人類SHSY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[14]。有研究顯示在BV2細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)IL- 1β的分泌是以NLRP3炎癥小體依賴的方式進(jìn)行；與正常對(duì)照組相比，AD患者血漿中的CTSB活性、IL- 1β和丙二醛顯著升高[5]。CTSB作用于一定的底物后也能產(chǎn)生N-截短的聚谷氨酸-β淀粉樣蛋白(poly-glutamate-beta-amyloid，pGlu-Aβ)，而pGlu-Aβ已被證明是多種形式的Aβ肽中神經(jīng)毒性很強(qiáng)的肽。另外，CTSB抑制劑E64d能夠降低pGlu-Aβ和其他相關(guān)Aβ肽的產(chǎn)生[10]；在針對(duì)神經(jīng)性炎癥的發(fā)生發(fā)展方面，推測(cè)CTSB抑制劑CA- 074Me與E64d可能有類似作用。筆者認(rèn)為組織蛋白酶B 誘導(dǎo)的神經(jīng)性炎癥變化在本質(zhì)上是一種免疫性炎癥反應(yīng)；免疫反應(yīng)適當(dāng)時(shí)可能具有神經(jīng)保護(hù)作用，免疫反應(yīng)過(guò)度時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)或加重AD的發(fā)生。有學(xué)者通過(guò)對(duì)BV2細(xì)胞中不同處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析，認(rèn)為CTSB對(duì)NLRP3炎癥小體的激活調(diào)控需要鈣離子信號(hào)的介導(dǎo)；然而，鈣離子信號(hào)本身或可能通過(guò)其他途徑的活化信號(hào)激活NLRP3炎癥小體；鈣離子信號(hào)的傳導(dǎo)在上游、起始端到復(fù)合體的組裝等環(huán)節(jié)均調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活化[6]；推測(cè)在一定條件下，CTSB基因能夠通過(guò)NLRP3炎癥小體的信號(hào)通路調(diào)節(jié)BV2細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。

siScr：小干擾；siRNA：小干擾RNA

siScr：small interfering scramble；siRNA：small interfering RNA

A.TRPML1 siRNA有效地沉默TRPML1表達(dá)；B.TRPML1 siRNA 顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的CTSB蛋白表達(dá)

A.TRPML1 siRNA effectively silenced TRPML1 expression；B.TRPML1 siRNA significantly inhibited the protein expression of H2O2-induced CTSB

圖3沉默TRPML1表達(dá)水平影響H2O2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子EB蛋白和CTSB蛋白表達(dá)

Fig3Silencing of TRPML1 expression level affects H2O2-induced transcription factor EB and CTSB protein expressions

來(lái)自溶酶體的組織蛋白酶的分泌通過(guò)半胱天冬酶依賴性和半胱天冬酶非依賴性途徑參與溶酶體膜透化介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。由溶酶體的破裂或者晶體的吞噬作用所觸發(fā)的CTSB的釋放將會(huì)導(dǎo)致NLRP3炎性小體的激活、并導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL- 1β和IL- 18的分泌，這些作用過(guò)程與AD的發(fā)病有關(guān)[15]。Colletti等[16]認(rèn)為溶酶體離子通道蛋白TRPML1的缺失很可能會(huì)導(dǎo)致CTSB依賴性的細(xì)胞凋亡；他們發(fā)現(xiàn)在TRPML1 基因被沉默后，溶酶體CTSB易位到細(xì)胞質(zhì)中，由Bax介導(dǎo)而引發(fā)細(xì)胞凋亡；由于Bax活性的抑制不阻止CTSB的釋放，表明該蛋白質(zhì)位于CTSB的下游；推測(cè)細(xì)胞色素C的釋放、線粒體的滲透和半胱天冬酶的切割是隨后強(qiáng)化細(xì)胞凋亡發(fā)生的因素。本研究顯示，ROS能上調(diào)溶酶體鈣離子通道蛋白TRPML1和組織蛋白酶B的表達(dá)，當(dāng)用不同濃度的H2O2處理BV2細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)CTSB與TRPML1蛋白均有相似或同步的變化；而在200 μmol/L處理組與正常對(duì)照組比較，TRPML1 mRNA表達(dá)明顯增加，提示在BV2的氧化應(yīng)激損傷模型中，CTSB對(duì)NLRP3炎癥小體的活化作用有可能與TRPML1基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。胱抑素C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，相關(guān)基因能在所有的有核細(xì)胞內(nèi)以恒定速度持續(xù)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，并無(wú)組織特異性。本研究顯示胱抑素C的mRNA 表達(dá)水平在處理組與對(duì)照組之間無(wú)差異。CTSB是一類半胱氨酸蛋白酶家族，在人體中有11亞類[17]，本研究顯示H2O2顯著上調(diào)TRPML1和CTSB表達(dá)，比較輕微上調(diào)CTSD表達(dá)，但不影響CTSL和CTSV；推測(cè)ROS可能是通過(guò)TRPML1激活CTSB而不破壞溶酶體膜，結(jié)果不涉及其他類型組織蛋白酶。推測(cè)H2O2處理BV2細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)的CTSB和TRPML1蛋白增加可能有一定的組織特異性。

CTSB在一定條件下具有活化NLRP3炎癥小體的作用，這種作用是否受到溶酶體鈣離子通道蛋白TRPML1的影響？Man和Kanneganti[18]認(rèn)為，CTSB與TRPML1在溶酶體中通過(guò)相互作用，從而維持轉(zhuǎn)錄因子EB的抑制并降低自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。Qi等[19]研究顯示CTSB的遺傳缺失或藥理學(xué)抑制將會(huì)通過(guò)下調(diào)雷帕霉素的作用或者通過(guò)TRPML1激活TFEB觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致溶酶體生物合成的增加和自噬作用的增強(qiáng)。本研究顯示沉默TRPML1基因表達(dá)后能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的CTSB表達(dá)，H2O2處理組與正常對(duì)照組比較，CTSB或TFEB蛋白的表達(dá)均顯著增加；而H2O2+siRNA 組與H2O2組比較，CTSB蛋白的表達(dá)顯著減少。另外，Tseng等[20]研究顯示溶酶體鈣離子信號(hào)通過(guò)TFEB在人單核細(xì)胞中調(diào)節(jié)高葡萄糖介導(dǎo)的IL- 1β分泌。本研究在檢測(cè)CTSB蛋白的同時(shí)同步檢測(cè)TFEB，發(fā)現(xiàn)有類似的表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步支持TRPML1基因沉默后的病理生理作用涉及到轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CTSB基因的表達(dá)調(diào)控?？傊?，CTSB在小膠質(zhì)細(xì)胞中通過(guò)鈣離子信號(hào)通路的介導(dǎo)能夠活化NLRP3炎癥小體，通過(guò)抑制CTSB活性或沉默TRPML1基因的表達(dá)有可能控制ROS對(duì)神經(jīng)性炎癥的促進(jìn)作用。