牛樟芝菌種培養(yǎng)基質(zhì)篩選

蔣忠成 鄭 元 張 穎 楊宇明 王 娟 陳 翔

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牛樟芝菌種培養(yǎng)基質(zhì)篩選

蔣忠成1鄭 元1張 穎2*楊宇明3王 娟4陳 翔5

（1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224；3. 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201；4. 西南林業(yè)大學(xué)西南綠色發(fā)展研究院， 云南 昆明 650224；5. 福建省林業(yè)科技試驗中心，福建 南靖 353600）

采用固體恒溫暗培養(yǎng)的方式，通過改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)基質(zhì)，探究牛樟芝菌絲體對不同碳氮源的效應(yīng)。結(jié)果為：蛋白胨和果糖是菌絲生長的最適氮源和碳源，最優(yōu)的種源是2號，3、5和6號次之。不同碳氮源分別在10～15天、15～20天平均生長速度最快。對比發(fā)現(xiàn)，牛樟芝菌絲體在葡萄糖、胡蘿卜基質(zhì)上生長最快的是10～15天。在胡蘿卜、果糖基質(zhì)上的菌落顏色最鮮艷。

牛樟芝；氮源；碳源；種源；篩選

牛樟芝（(M. Zang & C.H. Su) Sheng H. Wu, Z.H. Yu, Y.C. Dai & C.H. Su）隸屬擔(dān)子菌門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科、臺芝屬，寄生于牛樟樹上，是一種珍稀藥用真菌，原產(chǎn)于中國臺灣[1]，大陸無自然分布[2]。牛樟芝含有多種生理活性物質(zhì)，其中β- D-葡聚糖和三萜類化合物的活性強，同時還含有超氧歧化酶和核酸類等，具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗細(xì)菌、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、抑制血小板凝集及保護(hù)肝臟等藥用功效[3-7]。牛樟芝在臺灣被公認(rèn)為解毒劑，且效果非常明顯[8]。

由于野生牛樟芝數(shù)量稀少，藥用價值很高，在臺灣民間有“森林中的紅寶石”之稱[9]。對牛樟芝的研究已有許多相關(guān)的報道[10-13]。本文旨在篩選牛樟芝菌種的保存和培養(yǎng)條件，對比其菌絲在不同時段的生長速度，挑選適合牛樟芝菌絲體生長的培養(yǎng)基質(zhì)和具有生長優(yōu)勢的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用7個牛樟芝瓶裝菌株，其中來自臺灣嘉義縣阿里山達(dá)邦地區(qū)2個（編號1、2），桃源縣的南莊地區(qū)2個（編號3、4），花蓮縣中央山脈的秀姑巒地區(qū)2個（編號5、6）、屏東縣的關(guān)山地區(qū)1個（編號7）。

使用試劑有甘露糖、麥芽浸粉、維生素B1、牛肉浸粉、酪蛋白胨、木糖、果糖、木糖醇、魚蛋白胨、酵母粉、牛肉蛋白胨、硫酸鎂、硝酸鈉、瓊脂等。

1.2 試驗方法

（1）菌種的保存活化?；罨囵B(yǎng)基：葡萄糖20 g/ L、硫酸鎂0.5 g/ L、馬鈴薯200 g/L（煮汁）、酵母粉5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L 、維生素B10.1 g/L、瓊脂16 g/L，pH自然。裝瓶、滅菌、倒皿及接種后，在黑暗條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察至菌絲長滿瓶。

（2）培養(yǎng)基篩選。①兩個基礎(chǔ)（對照）培養(yǎng)基。1號培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨6 g/L、瓊脂16 g/L，pH 自然。2號培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g/L（煮汁）、葡萄糖20 g/L、瓊脂16 g/L，pH自然。②不同氮源培養(yǎng)基。用等量的7種氮源（硫酸銨、硝酸鈉、酪蛋白胨、麥芽浸粉、酵母浸粉、牛肉浸粉、魚蛋白胨）分別代替1號培養(yǎng)基中的蛋白胨[14]，配制成不同氮源的培養(yǎng)基處理，每處理設(shè)3個重復(fù)。③不同碳源培養(yǎng)基。用等量的其他5種碳源（麥芽糖、甘露醇、果糖、木糖、木糖醇）分別代替2號培養(yǎng)基中的葡萄糖[14]，配制成不同碳源的培養(yǎng)基，每處理設(shè)3個重復(fù)。

（3）培養(yǎng)方法和觀測指標(biāo)。在無菌條件下采用平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)[15]，將長滿牛樟芝菌絲的平板和所要篩選的培養(yǎng)基放入超凈工作臺進(jìn)行紫外線消毒處理后接種，然后恒溫暗培養(yǎng)。每隔2天觀測菌絲的生長情況和菌落特征，從接種的第2天開始測量菌落的生長直徑，30天后評價菌落長勢。菌落長勢的評級標(biāo)準(zhǔn)=（菌絲密度×菌落顏色）÷2[16]。菌絲密度以“+”的個數(shù)表示；菌絲顏色偏紅程度以“☆”的個數(shù)表示。

菌絲生長指數(shù)=菌絲生長速度（mm/d）×菌落長勢；不同培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲生長的影響用菌絲生長指數(shù)表示[17，18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源的效應(yīng)

牛樟芝菌絲在8種培養(yǎng)基質(zhì)中均可生長，且經(jīng)差異顯著性檢驗各處理間菌絲生長的差異均為極顯著。菌落直徑，以蛋白胨培養(yǎng)基較大，達(dá)64.38 mm，高出其他氮源基質(zhì)7.8%～33.9%；菌落顏色評級為4☆，菌絲密度4+，長勢評級為4。硝酸鈉培養(yǎng)基菌落直徑較小，為42.57 mm，但菌絲密度和菌落顏色分別為4+和5☆，長勢評級也為4。長勢評級較低的是魚蛋白胨基質(zhì)，僅為2。蛋白胨基質(zhì)菌絲生長快速，平均生長速度為1.78 mm/d，比其他7種基質(zhì)高9.6%～41.0%。表明蛋白胨培養(yǎng)基為最適宜牛樟芝菌絲體生長的氮源，其生長指數(shù)達(dá)到7.12，比其他氮源高出9.6%～65.4%。

由表2可知，2號菌株在蛋白胨和硝酸鈉，3號菌株在酵母浸粉，6號菌株在酪蛋白胨和酵母浸粉基質(zhì)上的生長速度較快，平均達(dá)到2.63 mm/d。硫酸銨、硝酸鈉和魚蛋白胨培養(yǎng)基4號菌株菌絲不生長，硝酸鈉培養(yǎng)基對7號菌株也無生長效應(yīng)。1號菌株適宜氮源為蛋白胨，菌絲生長速度為2.03 mm/d，明顯高于其他5種基質(zhì)；2號菌株適宜氮源是蛋白胨和硝酸鈉；3號菌株適宜酵母浸粉；試驗所使用的8種氮源對4號菌株的生長促進(jìn)作用均較?。?號菌株適宜氮源為魚蛋白胨；6號菌株適宜氮源為酵母浸粉和酪蛋白胨；7號菌株適宜氮源為酪蛋白胨基質(zhì)。

圖1為不同氮源基質(zhì)7個牛樟芝菌株各時段的平均生長速度，可看出，15～20 d，牛樟芝菌株菌絲平均生長速度以酵母浸粉基質(zhì)最高，為5.62 mm/d，較同時段內(nèi)其他氮源基質(zhì)高18.5%～70.3%。1～5 d各基質(zhì)菌絲生長均較慢；5～10 d蛋白胨培養(yǎng)基菌絲生長速度（3.14 mm/d）顯著高出其他7種氮源51.6%～84.7%；10～15 d以酪蛋白胨基質(zhì)菌絲生長速度較快，為3.00 mm/d；20～25 d以麥芽浸粉培養(yǎng)基菌絲生長較快，為3.44 mm/d；25～30 d菌絲生長急劇變慢。硫酸銨、牛肉浸粉、麥芽浸粉和魚蛋白胨基質(zhì)20～25 d時菌絲體生長最快；硝酸鈉、酪蛋白胨和酵母浸粉基質(zhì)15～20 d菌絲生長較快。

表1 不同氮源基質(zhì)牛樟芝菌絲體的生長表現(xiàn)

注：①“+”越多，密度越高；“☆”越多，顏色越深；菌落長勢評級數(shù)值越高，表示長勢越好，表3同。②菌絲生長速度，各處理間呈極顯著差異，表3同。

表2 不同氮源與各牛樟芝菌株菌絲生長的關(guān)系（單位：mm/d）

圖1 不同氮源基質(zhì)不同時段牛樟芝菌絲的生長速度比較

表3 不同碳源基質(zhì)牛樟芝菌絲的生長情況

2.2 不同碳源的效應(yīng)

用胡蘿卜提取物和不同碳源培養(yǎng)牛樟芝，分析測得的數(shù)據(jù)，獲得牛樟芝菌絲體生長指標(biāo)的變化。

從表3可以看出，6種不同碳源的培養(yǎng)基對牛樟芝的生長均有一定的促進(jìn)作用。菌絲密度和菌落顏色，以葡萄糖、麥芽糖、果糖和木糖基質(zhì)較好，分別為5+和5☆；甘露糖和木糖醇次之，分別為4+和3☆。菌落直徑以果糖較大，達(dá)81.62 mm；木糖醇較小，為76 mm。菌絲體生長速度果糖基質(zhì)為2.35 mm/d，高于其他6種碳源。綜合表1、3可知，牛樟芝菌絲生長受碳源的影響大于氮源。

生長指數(shù)方面，葡萄糖、木糖和麥芽糖相差很小，分別為10.33、10.29和10.39；木糖醇基質(zhì)較低，為7.58；果糖基質(zhì)較高，達(dá)10.59（表3）。故果糖是最適宜牛樟芝菌絲生長的碳源。

圖2 不同碳源基質(zhì)各牛樟芝菌株菌絲生長速度比較

6種碳源對牛樟芝菌絲體的生長均有促進(jìn)作用但效果有明顯差異（圖2）。1號菌株適宜碳源為果糖；在不同基質(zhì)中2號菌株的平均生長速度均較快，為2.63 mm/d；3號菌株適宜碳源為葡萄糖、果糖、木糖和木糖醇4種，平均生長速度較快；6種碳源對4號菌株生長促進(jìn)作用均??；麥芽糖、果糖和木糖3種基質(zhì)對5號菌株生長的促進(jìn)作用較好；葡萄糖、麥芽糖、果糖和木糖4種基質(zhì)對6號菌株生長促進(jìn)作用較大；7號菌株適宜麥芽糖基質(zhì)。綜上可知，2號菌株最佳，在不同碳源基質(zhì)上的平均生長速度均最快，其次是3、5和6號，4號較差。

圖3為不同碳源基質(zhì)7個牛樟芝菌株各時段的平均生長速度，可以看出，10～15 d菌絲平均生長速度最高的是葡萄糖基質(zhì)（8.08 mm/d），比同時段其他培養(yǎng)基高出17.0%～46.5%；25～30 d葡萄糖基質(zhì)平均生長速度僅0.03 mm/d，生長幾乎停滯。1～10 d和20～25 d甘露糖基質(zhì)菌絲生長較快；15～20 d生長最快的是麥芽糖，平均生長速度4.32 mm/d，比同時段其他培養(yǎng)基高出12.3%～69.4%。25～30 d果糖基質(zhì)菌絲體生長快；15～20 d是麥芽糖基質(zhì)菌絲生長速度快；10～15 d甘露糖基質(zhì)對牛樟芝菌絲體生長的促進(jìn)作用最好。

圖3 不同碳源基質(zhì)不同時段牛樟芝菌絲的生長速度比較

3 結(jié)論與討論

綜合菌落長勢、生長速度和生長指數(shù)各項指標(biāo)，以蛋白胨為氮源，采用蛋白胨、葡萄糖基質(zhì)對生長促進(jìn)作用明顯優(yōu)于其他幾種氮源，菌絲體平均生長速度可達(dá)1.78 mm/d。菌落直徑64.38 mm，長勢評分達(dá)4分，菌落大多偏紅，少數(shù)淡黃色或白色。

以果糖為碳源，采用胡蘿卜提取物、果糖基質(zhì)培養(yǎng)，對菌絲體生長的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于其他幾種碳源，菌落直徑81.62 mm，平均生長速度達(dá)2.35 mm/ d，長速最快的時間段是10～15 d，達(dá)到4.42 mm/ d，生長指數(shù)最大，為10.59，且菌絲紅色，與野生牛樟芝的顏色相近。

由此判定，不同的碳氮源基質(zhì)不僅對牛樟芝菌絲生長效應(yīng)具有顯著影響，還會對牛樟芝菌絲體合成的物質(zhì)造成顏色的差異。所以想要獲得顏色接近牛樟芝子實體且生長速度快的菌絲體，適宜選擇的氮源和碳源分別是胡蘿卜提取物和果糖。

比較牛樟芝不同菌株在基質(zhì)上菌絲體的密度、顏色和平均生長速度，2號菌株是最優(yōu)種源，其在不同基質(zhì)上的生長能力都很強，平均生長速度達(dá)到2.63 mm/d，且菌絲密度和顏色均優(yōu)，3、5和6號次之。

本研究所得最佳氮源是蛋白胨，與前人的研究報道最佳氮源是牛肉浸粉[16]有一定差異，從菌落生長速度來看，本研究的結(jié)果明顯快于前人研究的生長速度（1.78 mm/d＞1.47 mm/d）[19]?？赡艿脑蚴遣煌瑏碓床煌L時期不同菌株的菌絲體對碳氮源的利用存在差異，導(dǎo)致牛樟芝在不同碳氮源培養(yǎng)基上生長形態(tài)和生長速度出現(xiàn)差異。結(jié)合牛樟芝菌絲體在不同時間段的生長特點，其延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期各為1～5 d、10～15 d、15～25 d和25 d后。

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Screeningculture medium of

Jiang Zhongcheng1Zheng Yuan1Zhang Ying2*Yang Yuming3Wang Juan4Chen Xiang5

(1. College of Forest, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 3. Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, China; 4. Southwest Green Development Research Institute, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 5. Forestry Science and Technology Test Center in Fujian, Nanjing 353600, China)

In this research, different nitrogen and carbon sources were used to culture myceliumofon solid constant temperature condition, for explore the effects of mediums on the growth of mycelium, and the growth status of the mycelium were regularly observed. The results showed that the optimal nitrogen and carbon sources for the growth of mycelium ofwere peptones and fructose. The best strain is No. 2, No. 3, 5and 6 came second. The average maximum growth rate of different carbon and nitrogen sources were 10～15d or 15～20d after inoculation, respectively. By comparing the average growth rate of each nitrogen and carbon source at different periods, it was found that mycelium grew fastest in the culture medium with carrot extract as the nitrogen source and glucose as the carbon source. When carrot extract was taken as nitrogen source and fructose as carbon source, the colony color was redder, which was the closest to the wild fruitbody color of. The results can be used to estimate the growth rate of,strains expanding propagation, liquid fermentation and wood inoculation.

; the best source; strain screening

S567.3+1

B

2095-0934（2019）03-199-06

云南省科技計劃項目“牛樟樹、牛樟芝優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源及其培育關(guān)鍵技術(shù)引進(jìn)”（2015IA004），西南林業(yè)大學(xué)科研項目“牛樟樹、牛樟芝重要功效成分生理代謝”（2176062），云南省博士后定向培養(yǎng)資助

蔣忠成（1994—），男，云南人，主要從事食藥用真菌研究。

張穎（1978—），女，云南人，講師，主要從事大型真菌多樣性研究，E-mail：yingb.zhang@swfu.edu.cn。