張宏,李剛，趙福永 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

我國(guó)是世界油菜(BrassicanapusL.)生產(chǎn)大國(guó)，其種植面積及總產(chǎn)量均占全球的30%左右[1]。當(dāng)前，我國(guó)農(nóng)村發(fā)展方向從增產(chǎn)增收逐漸轉(zhuǎn)向?yàn)樯鷳B(tài)農(nóng)業(yè)。生態(tài)農(nóng)業(yè)不僅可以滿足食用需求，而且可以作為特色旅游產(chǎn)業(yè)為農(nóng)村發(fā)展打開新天地[2]，因此彩色油菜的選育具有重大的旅游與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。以甘藍(lán)型綠葉油菜與野生芥菜型紫葉油菜為親本，雜交得到F1代雜種后，經(jīng)多代自交，紫葉性狀已穩(wěn)定遺傳。本研究對(duì)選育的甘藍(lán)型紫葉油菜品種進(jìn)行紫葉葉色性狀的遺傳分析，對(duì)葉片中紫色分布情況進(jìn)行觀察，測(cè)定其色素含量，并對(duì)花青素的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

a、c、e:“中雙11號(hào)”；b、d、f:自交系紫葉品種圖1 “中雙11號(hào)”與自交系紫葉油菜植株及葉片

以甘藍(lán)型綠葉油菜“湘油15號(hào)”為母本，以野生芥菜型紫葉油菜為父本，在作物試驗(yàn)田雜交得到F1代種子[3]，F(xiàn)1代自交生成F2代植株。再經(jīng)多代自交后，獲得穩(wěn)定紫色葉色性狀的甘藍(lán)型油菜品種(圖1)。對(duì)照綠葉品種“中雙11號(hào)”(ZS11)為套袋自交留種。

1.2 紫色葉色性狀的遺傳規(guī)律分析

采用親本自交、雜交，F(xiàn)2代植株自交和回交，觀測(cè)子代植株苗期葉色性狀，得出紫色葉色與綠色葉色性狀分離比，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法χ2測(cè)驗(yàn)[4]進(jìn)行適合性檢驗(yàn)。

1.2.1 親本自交、雜交，初步預(yù)測(cè)紫葉與綠葉性狀顯隱性

2016年10月，在作物試驗(yàn)田，播種純合甘藍(lán)型綠葉油菜“湘油15號(hào)”(母本)與純合野生芥菜型紫葉油菜(父本)，于花期選取健康植株做自、雜交(正交與反交)試驗(yàn)得到F1代種子。F1代植株自交收獲F2代種子，并統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量。

試驗(yàn)地設(shè)計(jì)小區(qū)為4m2,共20個(gè)小區(qū),各試驗(yàn)小區(qū)有相同的水、肥、氣、熱條件。隨機(jī)選取2塊小區(qū)各播種100株母本、父本自交F2代種子，行、株距為17cm，隨機(jī)選取8塊小區(qū)各播種100株正交F2代種子，隨機(jī)選取10塊小區(qū)各播種100株反交F2代種子。于苗期觀測(cè)葉色分離比，并用χ2測(cè)驗(yàn)進(jìn)行適合性檢驗(yàn)。

1.2.2 F2代植株回交，觀測(cè)BC1代植株性狀確認(rèn)遺傳特征

2017年10月，在作物試驗(yàn)田播種純合甘藍(lán)型綠葉油菜“湘油15號(hào)”(母本)、純合野生芥菜型紫葉油菜(父本)、F1代雜合種子，于花期選取健康植株回交。收獲種子，并統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量。

試驗(yàn)地設(shè)計(jì)小區(qū)為4m2,共8個(gè)小區(qū)，各試驗(yàn)小區(qū)有相同的水、肥、氣、熱條件。隨機(jī)選取5塊小區(qū)各播種100株F1代雜合子與母本(純合“湘油15號(hào)”綠葉油菜)回交獲得的子代BC1a種子，隨機(jī)選取3塊小區(qū)各播種100株F1代雜合子與父本(純合野生芥菜型紫葉油菜)回交獲得的子代BC1b種子，行、株距均為17cm。于苗期觀測(cè)葉色分離比，用χ2測(cè)驗(yàn)進(jìn)行適合性檢驗(yàn)。

1.3 甘藍(lán)型紫葉油菜葉片的解剖學(xué)特征觀察

2017年1月6日，取甘藍(lán)型紫葉油菜、“中雙11號(hào)”綠葉油菜健康葉片，用樣品袋存放于冰盒中運(yùn)至顯微室。制作徒手切片,在UM158A光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)下觀察、拍照。

1.4 甘藍(lán)型紫葉油菜葉片各色素含量測(cè)定

2016年12月27日，選取健康甘藍(lán)型紫葉油菜10株，分別取其第10片真葉；選取1株健康“中雙11號(hào)”綠葉油菜，取第10片真葉。用樣品袋編號(hào)存放于冰盒中。

1.4.1 藍(lán)型紫葉油菜葉片花青素的提取及含量測(cè)定

參考Li等[5]的葉片花青素提取方法，本研究采用95%乙醇∶1.5mol/L鹽酸=85∶15(V∶V)配制花青素提取液。在預(yù)冷的潔凈研缽中，用液氮研磨樣品。各取0.4g研磨物置于相應(yīng)編號(hào)的10mL離心管中,再分別加入4mL花青素提取液，于4℃、黑暗條件下150r/min輕搖18h。將混合溶液在4℃、5000r/min條件下離心10min。取上清液至潔凈新管，置冰上保存，用UV-2600型紫外分光光度計(jì)(日本島津)測(cè)定波長(zhǎng)530nm的光密度D530nm,并按以下公式計(jì)算花青素含量：

Cant=D530nm·V·N/(98.2·M)

式中：Cant為花青素含量，mg/g;V為提取物體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；98.2為提取溶液的摩爾吸收值;M為葉片質(zhì)量，g。

1.4.2 甘藍(lán)型紫葉油菜葉片葉綠素、類胡蘿卜素的提取及含量測(cè)定

參考唐延林等[6]的葉片葉綠素、類胡蘿卜素提取方法，本研究用丙酮∶無(wú)水乙醇∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1(V∶V∶V)配比配制提取液。在預(yù)冷的潔凈研缽中，用液氮研磨樣品。各取0.2g研磨物置于相應(yīng)編號(hào)的潔凈的300mL錐形瓶中,再分別加入100mL提取液，于25℃、黑暗條件下150r/min輕搖至研磨物變?yōu)闊o(wú)色。將混合溶液在25℃、5000r/min條件下離心10min。取上清液至潔凈新管，置冰上保存，用UV-2600型紫外分光光度計(jì)(日本島津)分別測(cè)波長(zhǎng)為663nm(葉綠素a吸收峰)、645nm(葉綠素b吸收峰)、440nm的光密度值。按文獻(xiàn)[6]的方法計(jì)算葉綠素與類胡蘿卜素含量。

1.5 甘藍(lán)型紫葉油菜花青素在不同溫度和酸堿性條件下的穩(wěn)定性測(cè)定

1.5.1 磷酸緩沖液(pH=7)的配制

稱取13.61g的固體KH2PO4，用蒸餾水溶解，定容至100mL得甲液；稱取22.82g的固體K2HPO4·3H2O，用蒸餾水溶解，定容至100mL得乙液；量取3.85mL甲液與6.15mL乙液混合，用蒸餾水定容至100mL。

1.5.2 不同pH的花青素液制備

將提取到的花青素混合后，取混合液15mL，稀釋10倍，每30mL分裝至5個(gè)潔凈試管中，再分別加入10mL磷酸緩沖液，以NaOH溶液(1.5mol/L)、HCl溶液(1.5mol/L)用FE20-FiveEasyTMpH計(jì)(上海怡臨儀器)分別調(diào)節(jié)pH至1、3、5、7、9。經(jīng)改變pH的混合液，采用磷酸緩沖液定容至50mL，每8mL分裝至6個(gè)潔凈具塞試管中。

1.5.3 不同pH和溫度下花青素的穩(wěn)定性測(cè)定

將上述6份5種不同pH的花青素液分別在4℃冷藏、25℃常溫、45℃水浴、65℃水浴、85℃水浴、100℃沸水浴條件下處理20min。用數(shù)碼相機(jī)(Canon PowerShot G7)于自然光條件下拍照。用UV-2600型紫外分光光度計(jì)(日本島津)測(cè)波長(zhǎng)530nm的光密度D530nm，并計(jì)算各自花青素含量[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型紫葉油菜紫色葉色性狀的遺傳規(guī)律

試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，純合甘藍(lán)型綠葉油菜“湘油15號(hào)”自交F2代植株全為綠葉，純合野生芥菜型紫葉油菜自交F2代植株全為紫葉，不發(fā)生性狀分離。正交、 反交F1代植株全表現(xiàn)為紫色葉色性狀，F(xiàn)2代發(fā)生性狀分離，紫葉∶綠葉≈3∶1。正反交出現(xiàn)同樣的性狀分離比，說(shuō)明該葉色性狀為細(xì)胞核遺傳[7]。根據(jù)F2代性狀分離比得出結(jié)論：葉色紫色性狀對(duì)綠色性狀為顯性，且受1對(duì)等位基因控制[8]。

表1 紫葉芥與綠葉甘及其雜交F1、F2及BC1群體葉色統(tǒng)計(jì)

將F1代植株與純合母本(甘藍(lán)型綠葉油菜“湘油15號(hào)”)回交檢測(cè)，后代植株發(fā)生性狀分離，紫葉∶綠葉≈1∶1。將F1代植株與純合父本(野生芥菜型紫葉油菜)回交檢測(cè)，后代全表現(xiàn)為紫色葉色?；亟粰z測(cè)結(jié)果符合上述結(jié)論。

2.2 甘藍(lán)型紫葉油菜葉片的解剖學(xué)特征

取甘藍(lán)型紫葉油菜、“中雙11號(hào)”綠葉油菜健康葉片，制作徒手切片，在顯微鏡下以100倍、400倍放大倍數(shù)觀察切片，觀察結(jié)果(圖2、3)顯示紫葉葉片紫色分布在上表皮細(xì)胞及臨近的柵欄組織中。

圖2 甘藍(lán)型紫葉油菜葉片縱剖面顯微圖(左：100× 右：400×)

圖3 “中雙11號(hào)”綠葉油菜葉片縱剖面顯微圖(左：100×；右：400×)

2.3 甘藍(lán)型紫葉油菜葉片各色素含量測(cè)定

取10株甘藍(lán)型紫葉油菜與“中雙11號(hào)”綠葉油菜第10片真葉，提取花青素、葉綠素、類胡蘿卜素，并測(cè)定其含量。從圖4可以看出，甘藍(lán)型紫葉油菜葉片花青素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于“中雙11號(hào)”綠葉油菜；甘藍(lán)型紫葉油菜葉片葉綠素含量普遍低于“中雙11號(hào)”綠葉油菜；類胡蘿卜素含量?jī)烧咧g沒有明顯區(qū)別。

注:Z1～Z10為紫葉油菜葉片；ZS11為“中雙11號(hào)”綠葉油菜葉片圖4 甘藍(lán)型紫葉油菜與“中雙11號(hào)”綠葉油菜葉片的色素含量

2.4 甘藍(lán)型紫葉油菜花青素在不同溫度、酸堿性條件下的穩(wěn)定性

圖5 甘藍(lán)型紫葉油菜花青素在不同溫度和酸堿性條件下的顏色

溫度和pH是影響花青素顏色和穩(wěn)定性的2個(gè)最主要的因素。在可見光譜內(nèi)，花青素溶液的最大吸收峰在 530nm 處，而當(dāng)pH由1逐漸升到9時(shí)，其最大吸收峰會(huì)產(chǎn)生紅移現(xiàn)象，溶液紅色變淺而藍(lán)色或綠色會(huì)加深。對(duì)不同pH和溫度處理后的花青素溶液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH≤3時(shí)，花青素溶液的顏色仍表現(xiàn)為深紅色或紅色；當(dāng)5≤pH≤7時(shí)，花青素溶液顏色逐漸透明；當(dāng)pH≥9時(shí)，花青素溶液隨著溫度的升高由藍(lán)綠(4℃)逐漸變?yōu)闇\黃(100℃)。測(cè)定各自的光密度，計(jì)算花青素含量。將溫度、pH和對(duì)應(yīng)的花青素含量導(dǎo)入MATLAB R2017a 軟件，利用griddata函數(shù)構(gòu)建三維模型(圖6)。由圖6可以看到，隨溫度升高與pH增大，花青素含量逐漸降低，因此低溫、酸性條件有助于花青素的保留。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)油菜種植有著悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗(yàn)，把油菜生產(chǎn)融于新農(nóng)村建設(shè)和休閑旅游產(chǎn)業(yè)中，是一個(gè)嶄新的發(fā)展方向。種植具有觀賞價(jià)值的紫葉油菜不僅可滿足人們食用需求而且可以創(chuàng)造獨(dú)特的自然景觀，在鄉(xiāng)村旅游熱的今天能間接增加農(nóng)民收入。

花青素作為一種天然水溶性色素，安全、無(wú)毒，在食品、化妝品行業(yè)有著巨大的應(yīng)用潛力[9，10]?；ㄇ嗨剡€具有抗氧化活性，在預(yù)防神經(jīng)性、心血管疾病、癌癥和糖尿病等難治愈疾病方面有著重要作用[11]。紫葉油菜葉片含有豐富的花青素，為傳統(tǒng)上只作為油料作物的油菜提供了新的利用方向。

芥菜型油菜株型松散、枝葉稀疏，抗旱、抗寒，產(chǎn)量不高，主要分布在我國(guó)西北和西南的地區(qū)；甘藍(lán)型油菜植株高大，枝葉繁茂，耐寒、耐肥、產(chǎn)量更高，適用種植范圍更廣[12]，選育具有紫葉性狀的甘藍(lán)型油菜相比野生芥菜型紫葉油菜有著更大的實(shí)用價(jià)值。本研究以純合甘藍(lán)型綠葉油菜“湘油15號(hào)”(母本)與純合野生芥菜型紫葉油菜(父本)雜交，獲得了該雜交組合的F1雜交種子，隨后進(jìn)行了連續(xù)8年的自交和選擇，目前該甘藍(lán)型紫葉油菜紫葉性狀表現(xiàn)穩(wěn)定遺傳[3]。

圖6 不同溫度和酸堿性條件下的花青素含量

觀測(cè)、統(tǒng)計(jì)子代性狀分離比例，結(jié)合雜合F1代回交驗(yàn)證情況，符合孟德爾遺傳定律，葉色紫色性狀對(duì)綠色為顯性，且受1對(duì)等位基因控制。顯微觀察紫色葉片，發(fā)現(xiàn)紫色分布于葉片的上表皮及臨近的柵欄組織中。提取并測(cè)量甘藍(lán)型紫葉油菜與綠葉油菜葉片的花青素、葉綠素、類胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)紫葉的花青素含量遠(yuǎn)高于綠葉，葉綠素含量普遍低于綠葉。設(shè)置不同梯度的溫度與pH處理甘藍(lán)型紫葉油菜的花青素，觀測(cè)其含量得出結(jié)論：低溫、酸性環(huán)境能提高花青素的穩(wěn)定性，有利于花青素的保留。對(duì)紫色葉色的遺傳規(guī)律及表型研究，對(duì)紫葉油菜品種的選育及進(jìn)一步研究有著重要意義。