胡勝杰, 李 優(yōu), 周 瑩, 伊雄海, 鄧曉軍,陳 沁, 徐敦明, 鈕 冰(.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系,上海 00;.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 005;.上海杉達(dá)學(xué)院,上海 009;.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,福建 廈門 60)

保健食品是一種適于特定人群食用,不以治療為目的,且能夠調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的食品種類[1-4]。2001年,歐盟對(duì)保健食品中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行安全性評(píng)估,建立了肯定列表,規(guī)定保健食品中不得含有藥物成分[5]。我國(guó)《食品安全法》第三十四條明文規(guī)定,保健食品中禁止添加任何非食用添加物[6]。近年來,由于相關(guān)產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)激烈,部分不法商販為牟取暴利、肆意增強(qiáng)產(chǎn)品的療效,無視相關(guān)法規(guī),在保健食品中大量添加藥物甚至違禁藥物。消費(fèi)者若長(zhǎng)期服用此類產(chǎn)品會(huì)對(duì)健康造成巨大隱患。目前我國(guó)已發(fā)布的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)包括減肥[7]、降糖[8]、抗疲勞[9]類藥物的測(cè)定,基質(zhì)與化合物考察范圍的局限性較強(qiáng)。因此,建立跨基質(zhì)類別、跨藥品類別的檢測(cè)方法,對(duì)打擊違法添加行為、保障消費(fèi)者安全具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的檢測(cè)保健食品中非食用添加物的方法主要有毛細(xì)管電泳法(CE)[10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11,12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13-15]、高效液相色譜法(HPLC)[16]、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(LC-QTOF-MS)[17,18]等。其中,LC-MS/MS因靈敏度高、特異性強(qiáng),已廣泛應(yīng)用于食品、藥物檢測(cè)[19]。李丹等[20]采用該技術(shù)檢測(cè)了膠囊類保健食品中36種解熱鎮(zhèn)痛、抗炎類藥物[20];黃芳等[15]使用該技術(shù)測(cè)定了片劑、膠囊類保健食品中17種壯陽類藥物;祝偉霞等[21]使用UPLC-MS/MS測(cè)定了片劑、顆粒、口服液類保健食品中26種非食用添加物,涉及減肥類、壯陽類等8類藥物。同時(shí)檢測(cè)口服液、片劑、膠囊、丸劑、膏劑中減肥、安眠、降血糖、降血壓、降血脂、消炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞類藥物的方法未見報(bào)道。

本研究以口服液、片劑、丸劑、膏劑、膠囊劑類保健食品為研究對(duì)象,采用QuEChERS方法與LC-MS/MS技術(shù),通過優(yōu)化前處理步驟與儀器參數(shù),建立了同時(shí)檢測(cè)保健食品中50種減肥、安眠、降血糖、降血壓、降血脂、消炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞類非食用添加藥物的快速分析方法。該法前處理簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng),為打擊保健品行業(yè)的非法添加行為,填補(bǔ)檢測(cè)技術(shù)空白以及保健食品突破國(guó)際貿(mào)易壁壘提供了可靠的技術(shù)儲(chǔ)備。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290 Infinity II液相色譜-6495三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司),配備有ESI源;Allegra X-22R Centrifuge離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);CM-1000高速振蕩器(日本EYELA公司);CPX5800H-C超聲清洗機(jī)(美國(guó)Branson公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸(純度≥99%,美國(guó)Fluka公司);實(shí)驗(yàn)所用50種藥物標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%,天津阿爾塔科技有限公司);尼龍針式過濾器(0.22 μm,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈉(NaCl)、檸檬酸鈉(TSCD)、檸檬酸氫二鈉(DHS)均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB)均購自北京迪馬科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

口服液、片劑、丸劑、膏劑、膠囊樣品均隨機(jī)購買于上海市的藥店、超市,密封,標(biāo)識(shí),置于4 ℃冰箱封存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,加入甲醇溶解,定容至10 mL,配制成1 g/L的儲(chǔ)備液密封,于-20 ℃下保存。分別移取上述50種單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋,分別制備成1 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 mg/L、1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃貯存。

1.3 樣品前處理

1.3.1固體、半固體樣品

片劑和丸劑:以研缽磨碎;膠囊:將殼與內(nèi)容物用研缽磨碎,混勻;膏劑:混勻。準(zhǔn)確稱取1 g代表性樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL甲醇,渦旋5 min,超聲提取30 min,加入4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g TSCD、0.5 g DHS,迅速振蕩5 min,于4 000 r/min下離心5 min,取1 mL上清液于2 mL離心管,加入50 mg PSA、50 mg C18、7.5 mg CARB、150 mg MgSO4,渦旋2 min,于12 000 r/min下離心5 min,取500 μL上清液,以甲醇定容至1 mL,過0.22 μm濾膜,供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3.2口服液

準(zhǔn)確稱取0.5 g于10 mL容量瓶中,以甲醇定容至10 mL,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,于12 000 r/min下離心5 min,取適量上清液,過0.22 μm濾膜,供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 儀器條件

色譜條件:Phoroshell SB C18色譜柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm;美國(guó)Agilent公司);流動(dòng)相A:0.1%(v/v)甲酸水溶液,B:乙腈;洗脫程序:0～1.0 min,5%B;1.0～1.5 min,5%B～10%B;1.5～20.0 min,10%B～100%B,20.0～25.0 min,100%B;25.0～30.0 min,100%B～5%B;流速:0.30 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:1 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子模式、負(fù)離子模式同時(shí)掃描,MRM檢測(cè)模式,50種非食用添加物的保留時(shí)間、定性離子、定量離子、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取1 mg/L單一標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別于正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行母離子全掃描,得到各化合物的準(zhǔn)分子離子([M+H]+或[M-H]-),選取響應(yīng)值高的離子為母離子。再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,選擇干擾較小、豐度較強(qiáng)的兩對(duì)子離子分別作為定量、定性離子。最后通過優(yōu)化碰撞能量,使每種化合物的特征碎片離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1樣品提取溶劑的選擇

根據(jù)50種非食用添加物的化學(xué)特性,分別以甲醇、乙腈和水對(duì)添加濃度為1 mg/kg的片劑、膏劑、丸劑和膠囊劑進(jìn)行提取,計(jì)算回收率。結(jié)果表明,上述3種溶劑對(duì)37種非食用添加物的提取率接近,均符合檢測(cè)要求(>60.0%);對(duì)于剩余13種化合物,甲醇的提取率(>54.6%)比乙腈(<53.1%)和水(<45.1%)的提取率高。因此,選擇甲醇作提取劑。

2.2.2QuEChERS凈化劑的選擇與優(yōu)化

目前文獻(xiàn)報(bào)道的凈化方法主要有固相萃取法(SPE)[21]和QuEChERS法[22]。SPE法凈化效果好,但優(yōu)化步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng),不適于多類化合物檢測(cè)。QuEChERS法快速、簡(jiǎn)便、適用性廣,在非食用添加物的檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)中得到運(yùn)用[19]。商品化的QuEChERS法主要為萃取鹽與凈化劑的組合,緩沖體系主要有果蔬農(nóng)殘檢測(cè)方法AOAC 2007.10的醋酸鹽體系[23]和EN 15662的檸檬酸鹽體系[24]。

本實(shí)驗(yàn)考慮到藥物穩(wěn)定性,選擇酸性較弱的檸檬酸鹽體系作為QuEChERS緩沖體系,并以不同配方的吸附劑組合(MgSO4、MgSO4+PSA、MgSO4+PSA+C18、MgSO4+PSA+C18+GCB)對(duì)添加濃度為1 mg/kg的片劑、膠囊劑、膏劑和丸劑提取液凈化,計(jì)算回收率。結(jié)果(見圖1)表明,MgSO4可以除去部分水溶性雜質(zhì)[25],但由于凈化能力有限,主要干擾物未凈化完全,因此整體回收率無顯著變化;加入PSA后,各基質(zhì)中超過76%的藥物回收率得到提升,這與糖類、有機(jī)酸等主要干擾物質(zhì)被去除有關(guān)[26];加入C18后,整體回收率略有提升,可能與樣品含脂量低有關(guān),除去了部分脂質(zhì)等非極性干擾物;加入GCB后,整體回收率最好(74.9%～113.0%),色素被進(jìn)一步凈化,本底的干擾降至最低。因此,本實(shí)驗(yàn)最終采用MgSO4+PSA+C18+GCB協(xié)同凈化的方式,增強(qiáng)雜質(zhì)的凈化能力,降低離子抑制作用,提高方法的準(zhǔn)確度。

2.2.3基質(zhì)效應(yīng)

取口服液、片劑、膠囊、膏劑、丸劑代表性樣品,配制成0～100 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,按下列公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME):ME=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100%[27]。若ME在80%～120%范圍內(nèi),表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯;若ME>120%,表明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)顯著;若ME<80%,表明基質(zhì)抑制效應(yīng)顯著[28]。計(jì)算結(jié)果如表2所示,5種基質(zhì)的ME為56.6%～88.0%,74.4%的化合物基質(zhì)抑制效應(yīng)顯著。

表1 50種非食用添加物的分子式、保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Formula,retention times and MS/MS parameters of the 50 non-edible additives

CE:collision energy;* quantitative ion.

表2 50種非食用添加物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng) Table 2 Matrix effects of the 50 non-edible additives in different matrices %

因此，本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正,可消除離子抑制,改善回收率。

2.3 線性范圍和檢出限

在5種樣品中添加目標(biāo)化合物,以50種化合物的質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以S/N≥3與S/N≥10分別確定方法的檢出限與定量限。其中巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、氯美扎酮、司可巴比妥、普伐他汀鈉和格列齊特在0～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好,苯巴比妥的檢出限為1 mg/kg,定量限為2 mg/kg,其他6種藥物的檢出限為500 μg/kg,定量限為1 mg/kg;其余43種化合物在0～10 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限為10 μg/kg,定量限為20 μg/kg;以上所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

在上述5種空白基質(zhì)中分別添加終濃度相當(dāng)于1、2、10倍LOQ的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)6次,在優(yōu)化的條件下測(cè)定,結(jié)果見表3?？梢钥闯?口服液的平均回收率為82.8%～113.9%,RSD為0.7%～6.1%;片劑的平均回收率為65.4%～111.5%,RSD為1.6%～8.6%;膠囊劑的平均回收率為67.6%～115.5%,RSD為1.3%～8.9%;丸劑的平均回收率為71.0%～115.7%,RSD為1.5%～6.1%;膏劑的平均回收率為63.1%～111.7%,RSD為1.2%～7.5%,滿足檢測(cè)要求。

2.5 實(shí)際樣品檢驗(yàn)

應(yīng)用本方法對(duì)市售100份保健食品,包括褪黑素片、海狗人參丸、左旋肉堿膠囊、功能飲料等進(jìn)行測(cè)定。其中,3份功能飲料中檢出西布曲明,其定性、定量離子對(duì)的比例與空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白添加回收樣品匹配(偏差范圍<15%),定量結(jié)果分別為64.2 μg/kg、110.7 μg/kg、160.7 μg/kg ,其余樣品均未檢出50種非食用添加物。相關(guān)譜圖見圖2。

表3 50種非食用添加物在5種保健食品基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率和精密度Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs)of the 50 non-edible additives spiked in five kinds of health food matrices

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

圖2 空白口服液的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)、加標(biāo)樣品(400 μg/kg)與陽性樣品(160.7 μg/kg)中西布曲明的MRM色譜圖與質(zhì)譜圖Fig.2 MRM chromatograms and MS spectra of sibutramine in oral liquid matrix-matched standard solution (20 μg/kg),spiked sample (400 μg/kg),and actual sample (160.7 μg/kg)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了針對(duì)保健食品中可能違法添加的50種化合物的LC-MS/MS篩查與確證方法,同時(shí)對(duì)質(zhì)譜條件、提取溶劑、凈化劑組合等進(jìn)行了考察與優(yōu)化,并對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明,該法的前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高且實(shí)用性強(qiáng),為監(jiān)督保健品行業(yè)違法違規(guī)現(xiàn)象提供了有力的技術(shù)支持。