王玉嬌, 劉 通, 鄧亞美, 王嘉琦, 陳 虹, 花爾并, 張 峰*(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300000;.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所,北京 100176)

茶葉飲品被譽(yù)為世界三大飲料之一,我國(guó)是世界產(chǎn)茶大國(guó),其產(chǎn)量和銷(xiāo)量位居前列。目前一些茶葉生產(chǎn)廠家受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng),將香精成分添加至茶坯中,改善和增強(qiáng)茶葉的香氣。研究表明,部分香精成分具有一定的毒性,比如香豆素具有致癌性,會(huì)導(dǎo)致肝退化與壞死、血管變化與海綿狀血管瘤,而側(cè)柏酮具有神經(jīng)毒性,影響人類(lèi)的身體健康[1-4]。還有一部分香精成分因?yàn)闆](méi)有確切的毒理報(bào)道而被認(rèn)為對(duì)人體具有潛在威脅,因此我國(guó)食品安全管理部門(mén)、美國(guó)食品藥品管理局、歐洲食品安全局(EFSA)以及國(guó)際食用香料工業(yè)組織(IOFI)等對(duì)可用于食品的香精化學(xué)成分和含量都做出了明確限定[5]。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定茶葉不得添加香精香料,但是目前茶葉中外加香精的檢測(cè)方法十分欠缺。香豆素、側(cè)柏酮、2-己基噻吩、反式-β-金合歡烯、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-乙酸乙酯和肉桂酸丁酯只能以天然生成的形式存在于某些食品,禁止作為添加劑用于茶葉。然而由于這6種禁用香精成分都是具有特定清香和芳香氣味的揮發(fā)性化合物,建立快速、準(zhǔn)確的禁用香精成分檢測(cè)方法,對(duì)于保障茶葉質(zhì)量安全和促進(jìn)行業(yè)發(fā)展意義重大。

香精主要由揮發(fā)性化合物組成,用于食品中香精成分的定量和定性檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7-9]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[10-12]等。在復(fù)雜基質(zhì)多組分分析時(shí),氣相色譜法存在靈敏度低和檢測(cè)限高的缺點(diǎn);GC-MS技術(shù)采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式對(duì)化合物進(jìn)行確認(rèn),基質(zhì)復(fù)雜的樣品基質(zhì)干擾大,易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。GC-MS/MS是在GC-MS的基礎(chǔ)上增加了二級(jí)質(zhì)譜信息,因此選擇性和抗干擾能力更強(qiáng),定量更準(zhǔn)確[13,14]。QuEChERS技術(shù)基于吸附原理,將吸附劑直接加入樣品提取液中,使之通過(guò)渦旋振蕩與基質(zhì)干擾物充分接觸,將干擾物吸附在吸附劑上,達(dá)到樣品凈化的目的[15-17]。近年來(lái),QuEChERS技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、快速、高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)得到迅速發(fā)展,在食品領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

目前,針對(duì)這些香精的研究報(bào)道較少。譚麗容等[18]運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)了薄荷香精中的限用物質(zhì)反-2-己烯醛、α-己基肉桂醛、香豆素。周思等[19]運(yùn)用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定了植物飲料中測(cè)柏酮等9種植物毒素。其余化合物尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用QuEChERS前處理技術(shù),同時(shí)結(jié)合GC-MS/MS技術(shù),建立了針對(duì)茶葉中香豆素、側(cè)柏酮、2-己基噻吩、反式-β-金合歡烯、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-乙酸乙酯和肉桂酸丁酯的檢測(cè)方法。其中,QuEChERS技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、高效、成本低廉;GC-MS/MS靈敏度高,穩(wěn)定性好,定性定量準(zhǔn)確,抗基質(zhì)干擾強(qiáng)。該法可為茶葉中禁用香精的精準(zhǔn)測(cè)定提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

美國(guó)Agilent 7000C GC-MS/MS;GC配有7890A自動(dòng)進(jìn)樣器、多模式進(jìn)樣口和DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),數(shù)據(jù)采集由MassHunter完成;VORTEX KB-3渦旋振蕩器(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司);3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

6種禁用香精標(biāo)準(zhǔn)品:側(cè)柏酮(thujone)、2-己基噻吩(2-hexylthiophene)、香豆素(coumarin)、肉桂酸丁酯(butyl cinnamate)、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-乙酸乙酯(p-menthol-1,8(10)-diene-9-ethyl acetate)(純度>96%,購(gòu)自日本TCI公司),反式-β-金合歡烯(trans-beta-acacene,純度>98%,購(gòu)自美國(guó)ChromaDex公司),乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、丙酮(英國(guó)Fisher Scientific公司),乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA,德國(guó)Sigma-Aldrich公司)、石墨化碳黑粉末(GCB,德國(guó)CNW Technologies GmbH)、十八烷基鍵合硅膠(C18,美國(guó)Agilent公司)、無(wú)水硫酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取6種香精標(biāo)準(zhǔn)品(10.0±0.1)mg,分別置于10 mL容量瓶中,加入少許乙酸乙酯,混勻,待標(biāo)準(zhǔn)品溶解再加入乙酸乙酯,定容至10 mL,可得1 g/L的儲(chǔ)備液,在-20 ℃冰箱中保存待用。

分別精密移取6種香精的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯稀釋并定容至10 mL,可得10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取茶葉樣品1 g,置于50 mL離心管中,加入15 mL乙酸乙酯,渦旋1 min混勻,離心(25 ℃,8 000 r/min)5 min。將上清液15 mL加入第二個(gè)50 mL離心管中,然后加入10 mg無(wú)水硫酸鎂、5 mg C18和5 mg PSA,渦旋1 min,低溫離心5 min,用0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別稱(chēng)取不含目標(biāo)物的空白茶葉樣品1 g(精確至0.01 g),按1.3節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理。用基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)對(duì)各被測(cè)組分的質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)作圖,繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 6種化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and MS parameters of the six compounds

* Quantitative ion.

1.5 GC-MS/MS條件

色譜條件:色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量1.0 μL;載氣為氦氣(≥99.999%),流量1.0 mL/min。升溫程序:初始溫度40 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升到220 ℃,保持2 min。

質(zhì)譜條件:色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃;電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);溶劑延遲4 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的考察

氣相色譜的升溫條件是非常重要的參數(shù)。從初始溫度40 ℃上升到220 ℃,本實(shí)驗(yàn)考察了20、30、40 ℃/min 3種升溫速度時(shí)的情況。當(dāng)升溫速度為40 ℃/min時(shí),香豆素和反式-β-金合歡烯的保留時(shí)間相近,難以分開(kāi)。20和30 ℃/min兩種升溫速度均可實(shí)現(xiàn)6種化合物的良好分離,為節(jié)約時(shí)間,最終選擇升溫程序?yàn)?0 ℃/min。

2.2 質(zhì)譜條件的考察

三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化一般包括母離子、子離子以及碰撞能量等參數(shù)。在MRM參數(shù)優(yōu)化過(guò)程中,先通過(guò)全掃描模式選取質(zhì)荷比較大且相對(duì)豐度比較高的特征碎片作為母離子,然后將母離子進(jìn)一步裂解,選取2個(gè)或3個(gè)碎片離子作為子離子,然后對(duì)每一對(duì)母離子/子離子以響應(yīng)信號(hào)大小為依據(jù)優(yōu)化碰撞能量。表1為所有目標(biāo)化合物優(yōu)化后的母離子、子離子和碰撞能量的信息。圖1為6種化合物的MRM色譜圖。

圖1 6種禁用香精化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the six banned flavor compounds

圖2 提取溶劑對(duì)6種禁用香精化合物回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of the extraction solvent on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)

圖3 提取溶劑體積對(duì)6種禁用香精化合物回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of the volume of extraction solvent on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)

2.3 QuEChERS前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

為了確定合適的提取溶劑,實(shí)驗(yàn)以空白茶為基質(zhì),在30 μg/kg的加標(biāo)水平下,分別以正己烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮為提取溶劑,比較6種目標(biāo)物的提取效率,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)使用正己烷為提取溶劑時(shí),6種化合物的回收率普遍偏高,回收率在170.85%～227.0%之間;當(dāng)使用乙腈為提取溶劑時(shí),2-己基噻吩的回收率只有50.89%,而反式-β-金合歡烯的回收率高達(dá)171.23%;使用丙酮為萃取劑時(shí),除了p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-乙酸乙酯回收率在正常范圍內(nèi)(82.42%),其余5種化合物回收率偏低,在38.33%～71.58%之間;但當(dāng)使用乙酸乙酯時(shí),回收率全部在77.67%～99.42%之間,可滿(mǎn)足檢測(cè)要求,故最終選擇乙酸乙酯為最佳提取溶劑。

2.3.2提取溶劑體積的選擇

如圖3所示,以乙酸乙酯為提取溶劑,以加標(biāo)水平30 μg/kg的空白茶葉為基質(zhì),以回收率為指標(biāo),考察不同提取溶劑體積(3、5、8、10、15和20 mL)對(duì)各目標(biāo)物提取效率的影響。隨著提取溶劑體積的增大,目標(biāo)物的回收率增加;當(dāng)提取溶劑體積為10 mL時(shí),回收率基本趨于穩(wěn)定。為了確?；厥章实姆€(wěn)定,最后選擇15 mL作為提取溶劑的用量。

2.3.3凈化方法的選擇

圖4 凈化材料對(duì)6種禁用香精化合物回收率的影響(n=3)Fig.4 Effect of the purification material on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)

茶葉的基質(zhì)復(fù)雜,含有色素、碳水化合物、茶多酚、脂類(lèi)化合物等雜質(zhì)。PSA、C18、GCB是QuEChERS前處理方法中常用的吸附劑。PSA可通過(guò)極性吸附作用、陰離子交換作用去除多酚、脂類(lèi)等極性較強(qiáng)的雜質(zhì)。C18對(duì)脂肪的去除效果明顯。GCB主要用于吸附色素。本實(shí)驗(yàn)考察了分別加入10 mg GCB、10 mg C18和10 mg PSA,或5 mg PSA+5 mg C18吸附劑時(shí)的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示:C18對(duì)目標(biāo)化合物吸附性較強(qiáng),回收率在72%以下;當(dāng)使用GCB和PSA為凈化材料時(shí),p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-乙酸乙酯的回收率較低,分別為70.01%和74.40%;當(dāng)同時(shí)使用PSA和C18時(shí),凈化效果最好,化合物的回收率在93.52%～105.82%之間。另外,吸附劑用量是影響前處理凈化效果和回收率的重要因素。如果使用量小,凈化效果不明顯;如果使用量大,凈化效果明顯但回收率低,不能滿(mǎn)足檢測(cè)要求。通過(guò)實(shí)驗(yàn)最終確定PSA用量為5 mg,C18用量為5 mg。

2.3.4無(wú)水硫酸鎂用量的優(yōu)化

無(wú)水硫酸鎂作為脫水劑具有強(qiáng)大的吸水能力,與水結(jié)合后放出熱量,有利于目標(biāo)物的提取。如無(wú)水硫酸鎂用量過(guò)少,會(huì)造成吸水不充分;其用量過(guò)多,會(huì)導(dǎo)致回收率偏低。因此有必要考察無(wú)水硫酸鎂的用量。在提取過(guò)程中,分別考察了5、10、20、30和40 mg無(wú)水硫酸鎂時(shí)的回收率,其他條件不變。結(jié)果如圖5所示,10 mg硫酸鎂能完全去除樣品中的水,提取回收率較合理;隨著硫酸鎂用量的增加,回收率逐漸降低。因此,最終選擇無(wú)水硫酸鎂的用量為10 mg。

圖5 硫酸鎂用量對(duì)6種禁用香精化合物回收率的影響(n=3)Fig.5 Effect of the amount of magnesium sulfate on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于痕量物質(zhì)的分析過(guò)程中,并會(huì)給定量結(jié)果造成影響。本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比來(lái)確定基質(zhì)效應(yīng)(ME)[20]:

ME=(1-Ss/Sm)×100%

(1)

其中,Ss是基質(zhì)匹配曲線的斜率,Sm是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)-50%50%時(shí),該化合物的基質(zhì)效應(yīng)明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,6種香精化合物中除了側(cè)柏酮和2-己基噻吩,其余化合物均表現(xiàn)出一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此在實(shí)際檢測(cè)時(shí),為保證結(jié)果準(zhǔn)確,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)化合物進(jìn)行定量分析。

表2 6種禁用香精化合物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects (ME)of the six banned flavor compounds

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1檢出限、定量限和線性范圍

配制6種化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1～200 μg/L),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種化合物在1～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。在空白樣品中分別添加一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行前處理和測(cè)定,以3倍信噪比確定方法的檢出限(LOD),以10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)。如表3所示,各化合物的檢出限和定量限分別在0.005～0.1 μg/kg和0.02～2 μg/kg范圍內(nèi),表明該方法可以滿(mǎn)足復(fù)雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)檢測(cè)的要求。其中側(cè)柏酮和香豆素的定量限分別是0.02 μg/kg和1 μg/kg,比文獻(xiàn)[18,19]報(bào)道中GC-MS的檢測(cè)下限(2.4 μg/kg和30 μg/kg)大幅降低,表明本方法有效地降低了茶葉中其他雜質(zhì)和基質(zhì)背景的干擾,具有更高的檢測(cè)靈敏度。

表36種禁用香精化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Table 3 Linear ranges,correlation coefficients (R2), limits of detection and limits of quantitation of the six banned flavor compounds

表4 6種禁用香精化合物在茶葉中的添加回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)Table 4 Recoveries,intra-day precisions and inter-day precisions of the six banned flavor compounds spiked in tea (n=6)

ND:not detected.

2.5.2回收率和精密度

取空白茶葉樣品1 g,分別添加3個(gè)水平(1、2、4倍定量限)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平做6次平行,計(jì)算平均回收率和日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果如表4所示,6種化合物的平均回收率是82.3%～93.1%,日內(nèi)精密度在1.4%～4.1%之間,日間精密度在2.3%～6.5%之間。

2.5.3實(shí)際樣品檢測(cè)

針對(duì)10個(gè)市售的茶葉樣品,用本文建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表5所示,2-己基噻吩、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-乙酸乙酯、反式-β-金合歡烯、香豆素、肉桂酸丁酯5種化合物在實(shí)際樣品中均未檢出,而側(cè)柏酮?jiǎng)t在其中的8個(gè)樣品中檢出,含量最高達(dá)到268.225 μg/kg(色譜圖見(jiàn)圖6)。我國(guó)目前尚未有茶葉中側(cè)柏酮含量的限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟法規(guī)EC 1334/2008條例中規(guī)定,青蒿生產(chǎn)的飲料中側(cè)柏酮含量不得高于0.5 mg/kg(不含酒精飲料)和35 mg/kg(含酒精飲料),非青蒿生產(chǎn)的飲料中側(cè)柏酮含量不得高于10 mg/kg(含酒精飲料)。側(cè)柏酮有可能是茶葉樣品中的內(nèi)源性天然成分,有必要對(duì)其來(lái)源開(kāi)展進(jìn)一步研究。

圖6 陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of a positive sample

3 結(jié)論

本文利用QuEChERS技術(shù)同步提取和凈化茶葉樣品,結(jié)合GC-MS/MS建立了快速測(cè)定茶葉中6種禁用香精成分的分析方法。方法學(xué)評(píng)價(jià)和實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明,該方法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,凈化效果較好,可用于茶葉中多種禁用香精的檢測(cè)。