左 雪, 邸 錚, 張 蓉, 鄔國慶(北京市藥品檢驗所,北京 102206)

隨著人們生活水平的日益提高,染發(fā)作為一種美容方式,逐步成為流行時尚。合成染發(fā)劑主要分為暫時型、半永久型及永久型等3類[1],現(xiàn)今市場銷售的染發(fā)產(chǎn)品80%為永久型(又稱“氧化型”)[1,2]。氧化型染發(fā)產(chǎn)品中的染料中間體主要為芳香胺類、酚類化合物,這類成分具有一定的致敏性與致癌性[1-4]。因此,建立一種快速、準確的測定方法,為氧化型染發(fā)產(chǎn)品研發(fā)和監(jiān)管提供有效的技術手段,顯得十分重要。

目前,染發(fā)劑的檢測方法主要有離子色譜法[5]、液相色譜法[6-10]、氣相色譜法[11]、液相色譜-質譜法[12-14]、氣相色譜-質譜法[15,16]及超臨界流體色譜法[17]等。采用氣相色譜法進行檢測時,由于多數(shù)染發(fā)劑不具有良好的揮發(fā)性,而需通過衍生化處理,實驗過程較繁瑣,可測定成分種類也受到限制;液相色譜-質譜法雖具有良好的靈敏度與準確性,但分析復雜樣品時,易造成離子源污染,且儀器成本較高,不易普及;染發(fā)劑的強極性、不穩(wěn)定性及低揮發(fā)性等特征,使液相色譜法成為一種較為理想且易推廣的檢驗方法。《化妝品安全技術規(guī)范》(后簡稱“規(guī)范”)(2015年版)[18]中限定了74種準用染發(fā)劑,并規(guī)定了對苯二胺等32種組分的檢測方法,可實現(xiàn)多組分的分離與定量。嚴巍[19]等也根據(jù)pKa值差異實現(xiàn)了32種染發(fā)劑的分組測定。兩種方法涵蓋組分雖多,但均需同時建立3個色譜系統(tǒng),實驗過程耗時較長,對儀器、色譜柱及試劑的消耗較大。還有多篇文獻[6-10,20-22]通過建立單一色譜系統(tǒng)實現(xiàn)多種染發(fā)劑的含量測定,方法快速、簡便,但分析對象最多只涉及20種左右的禁限用組分,難以滿足對氧化型染發(fā)產(chǎn)品的監(jiān)管需求。

綜合考察氧化型染發(fā)產(chǎn)品配方,選定33種禁限用染發(fā)劑,建立了單一液相色譜系統(tǒng),同時實現(xiàn)多成分定量分析,為氧化型染發(fā)產(chǎn)品中染發(fā)劑的準確、高效檢測以及質量監(jiān)管提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

1260型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器,美國Agilent公司;KQ-500型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;CP225D型電子分析天平,德國Sartorius公司。

對苯二胺(p-phenylenediamine)、2,6-二氨基吡啶(2,6-diaminopyridine)、對氨基苯酚(p-aminophenol)、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽(toluene-2,5-diamine sulfate)、間苯二胺(m-phenylenediamine)、氫醌(hydroquinone)、間氨基苯酚(m-aminophenol)、4-氨基間甲酚(4-amino-m-cresol)、鄰苯二胺(o-phenylenediamine)、間苯二酚(resorcinol)、2-硝基對苯二胺(2-nitro-p-phenylenediamine)、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽(N,N-diethyltoluene-2,5-diamine HCl)、甲苯-3,4-二胺(toluene-3,4-diamine)、1-萘酚(1-naphthol)均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽(2,4-diaminophenoxyethanol HCl)、N,N-二乙基對苯二胺硫酸鹽(N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulfate)、對甲基氨基苯酚硫酸鹽(p-methylaminophenol sulfate)、6-羥基吲哚(6-hydroxyindole)、1,5-萘二酚(1,5-naphthalenediol)均購自北京曼哈格生物技術有限公司;四氨基嘧啶硫酸鹽(tetraaminopyrimidine sulfate)、2-氯對苯二胺硫酸鹽(2-chloro-p-phenylenediamine sulfate)均購自北京百靈威科技有限公司;2-甲基間苯二酚(2-methylresorcinol)、4-氨基-3-硝基苯酚(4-amino-3-nitrophenol)、4-氯間苯二酚(4-chlororesorcinol)、N-苯基對苯二胺(N-phenyl-p-phenylenediamine)均購自美國Sigma公司;4-氨基-2-羥基甲苯(4-amino-2-hydroxytoluene)、4-硝基鄰苯二胺(4-nitro-o-phenylenediamine)、6-氨基間甲酚(6-amino-m-cresol)均購自日本東京化成工業(yè)株式會社;2-氨基-3-羥基吡啶(2-amino-3-hydroxypyridine)、2,7-萘二酚(2,7-naphthalenediol)均購自加拿大TRC公司;4,5-二氨基-1-(2-羥乙基)吡唑硫酸鹽(1-hydroxyethyl 4,5-diaminopyrazole sulfate)、羥乙基對苯二胺硫酸鹽(hydroxyethyl-p-phenylenediamine sulfate)、N,N-雙(2-羥乙基)-對苯二胺硫酸鹽(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-p-phenylenediamine sulfate)均購自美國Ark Pharm公司。所有對照品純度均大于95%。

乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)購自法國Millipore公司;磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;亞硫酸氫鈉(分析純)購自北京化學試劑公司;無水乙醇(優(yōu)級純)購自現(xiàn)代東方(北京)科技發(fā)展有限公司。

樣品均為市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,包含染發(fā)膏和氧化乳兩種劑型。

1.2 溶液配制

流動相A相溶液:稱取5.6 g磷酸二氫鉀、3.6 g十二水合磷酸氫二鈉,加水溶解,稀釋并定容至1 000 mL,充分混勻后,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,得磷酸鹽緩沖液(0.04 mol/L磷酸二氫鉀+0.01 mol/L磷酸氫二鈉)。取960 mL上述緩沖液與40 mL乙腈充分混勻,備用。

稀釋溶劑:稱取0.2 g亞硫酸氫鈉,加入流動相A相溶液溶解,稀釋并定容至1 000 mL,充分混勻,備用。

標準儲備溶液:稱取染發(fā)劑對照品各50.0 mg,置于50 mL棕色量瓶中,加入10 mL無水乙醇以及適量稀釋溶劑,超聲至充分溶解,再加入稀釋溶劑至刻度,搖勻,即得混合標準儲備溶液。4 ℃保存。

1.3 樣品前處理

取樣品中染發(fā)膏0.5 g(精確到0.001 g),置于50 mL比色管中,分別加入5 mL無水乙醇以及5 mL稀釋溶劑,渦旋30 s,超聲15 min,放冷后加入稀釋溶劑至25 mL,渦旋30 s,充分混勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為Waters Atlantis?T3 MV Kit(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為25 ℃,進樣量為5 μL。流動相:A相為磷酸鹽緩沖液(0.04 mol/L磷酸二氫鉀+0.01 mol/L磷酸氫二鈉,含4%(體積分數(shù))乙腈),B相為乙腈。流速為1.0 mL/min。梯度洗脫程序見表1。氫醌、對甲基氨基苯酚硫酸鹽、間苯二酚、4-氯間苯二酚、6-羥基吲哚、1,5-萘二酚、2,7-萘二酚、N-苯基對苯二胺、1-萘酚等9種成分檢測波長為280 nm,其余成分檢測波長均為235 nm。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution procedure

Mobile phase A:0.04 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile (96∶4,v/v);mobile phase B:acetonitrile.

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描(210～400 nm),發(fā)現(xiàn)各成分的最大吸收波長均集中于225～245 nm及275～310 nm范圍,且低波長段響應值更強。綜合考慮各成分吸收特點后,將235 nm作為首選檢測波長。但氫醌、間苯二酚及N-苯基對苯二胺在280 nm下吸收強于235 nm,1,5-萘二酚、2,7-萘二酚及1-萘酚高濃度點在235 nm下響應超載,影響回歸方程的線性,對甲基氨基苯酚硫酸鹽、4-氯間苯二酚及6-羥基吲哚在235 nm下易受到基質與其他雜質峰的干擾,因此單獨在280 nm下檢測上述9個成分。33種染發(fā)劑在不同波長下的色譜圖見圖1。

圖1 33種染發(fā)劑混合標準溶液在兩種波長下的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of the mixed standard solution of 33 hair dyes at two wavelengths Peak Nos:1.1-hydroxyethyl 4,5-diaminopyrazole sulfate;2.tetraaminopyrimidine sulfate;3.2-amino-3-hydroxypyridine;4.p-phenylenediamine;5.hydroxyethyl-p-phenylenediamine sulfate;6.2,6-diaminopyridine;7.p-aminophenol;8.toluene-2,5-diamine sulfate;9.m-phenylenediamine;10.hydroquinone;11.2,4-diaminophenoxyethanol HCl;12.m-aminophenol;13.4-amino-m-cresol;14.N,N-bis(2-hydroxyethyl)-p-phenylenediamine sulfate;15.o-phenylenediamine;16.p-methylaminophenol sulfate;17.resorcinol;18.2-chloro-p-phenylenediamine sulfate;19.N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulfate;20.2-methylresorcinol;21.2-nitro-p-phenylenediamine;22.N,N-diethyltoluene-2,5-diamine HCl;23.4-amino-2-hydroxytoluene;24.toluene-3,4-diamine;25.4-nitro-o-phenylenediamine;26.4-amino-3-nitrophenol;27.6-amino-m-cresol;28.4-chlororesorcinol;29.6-hydroxyindole;30.1,5-naphthalenediol;31.2,7-naphthalenediol;32.N-phenyl-p-phenylenediamine;33.1-naphthol.

2.2 色譜柱的選擇

對比了4種色譜柱的分離效果:采用HALO RP-Amide(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱進行分析時,部分色譜峰峰形差,前延或拖尾現(xiàn)象嚴重;采用SUPELCO Discovery?RP Amide C16(250 mm×4.6 mm,5 μm)以及Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱時,大部分成分得到良好分離,且峰形較好,但仍有少數(shù)峰出現(xiàn)拖尾,另外,C16柱平衡時間較其他色譜柱更長,且貨源較少;采用Waters Atlantis?T3 MV Kit(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱時,各成分色譜峰峰形良好,整體分離效果優(yōu)于前述3種色譜柱。因此,最終選擇Waters Atlantis?T3 MV Kit柱對33種染發(fā)劑進行分離。

2.3 流動相的選擇

圖2 采用不同流動相時染發(fā)劑混合標準溶液HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatograms of the mixed standard solution of hair dyes with different mobile phases a.0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.005 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile;b.0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile;c.0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate+0.02 mol/L disodium hydrogen phosphate-acetonitrile.

2.4 提取溶劑的優(yōu)化

參考規(guī)范(2015年版)[18],選擇2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-無水乙醇(1∶1,v/v)作為提取與稀釋溶劑。在對33種染發(fā)劑對照品進行液相分析時,發(fā)現(xiàn)2-氨基-3-羥基吡啶、對苯二胺及羥乙基對苯二胺等3種成分的色譜峰出現(xiàn)“溶劑效應”。因此,利用前述溶劑溶解或提取后,加入1.5倍體積流動相A相溶液做進一步稀釋,所得溶液中各成分色譜峰峰形良好,可解決“溶劑效應”。但對此法制得對照品溶液進行穩(wěn)定性試驗時,發(fā)現(xiàn)四氨基嘧啶硫酸鹽和2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽在12 h內的穩(wěn)定性差,峰面積相對標準偏差超過20%,這可能是由于流動相中缺少抗氧化劑,兩種成分氧化分解嚴重。因此,進一步在A相溶液中添加適量亞硫酸氫鈉,可解決氧化分解問題。最終確定1.2節(jié)稀釋溶劑,并按1.3節(jié)方法處理樣品。

2.5 標準曲線、檢出限及定量限

用稀釋溶劑配制質量濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0 mg/L的標準曲線系列溶液,分別進樣5 μL,在1.4節(jié)色譜條件下進行分析。以對照品溶液質量濃度(mg/L)為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸。取0.5 g(精確到0.001 g)基質空白樣品(染發(fā)膏配方中不含本文的33種成分),加入不同濃度的混合標準溶液,按1.3節(jié)方法制備待測溶液,以信噪比(S/N)為3時對應的對照品濃度作為檢出限(LOD),S/N為10時對應的對照品濃度作為定量限(LOQ)。結果如表2所示,4-氨基-2-羥基甲苯、4-硝基鄰苯二胺在5～250 mg/L,其他成分在5～500 mg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)均高于0.999。

2.6 精密度

吸取5 μL 100 mg/L標準曲線系列溶液,按1.4節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6次,計算峰面積相對標準偏差(RSDs)。結果表明,所有成分峰面積RSDs值均低于2.0%,方法精密度良好。

表2 33種染發(fā)劑的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients,limits of detection (LODs),and limits of quantification (LOQs)of 33 hair dyes

Nos.are the same as the peak Nos.in Fig.1.A:peak area;C:mass concentration,mg/L.

2.7 穩(wěn)定性

取100 mg/L標準曲線系列溶液,室溫條件下分別于第0、4、8、12、16、20、24 h進行測定,進樣5 μL,在1.4節(jié)色譜條件下進行分析,計算各成分峰面積RSDs值。結果表明,四氨基嘧啶硫酸鹽和2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽在12 h內峰面積RSDs小于5%,其余31種成分在24 h內峰面積RSDs均小于5%,各成分穩(wěn)定性良好。但對于含有四氨基嘧啶硫酸鹽或2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的染發(fā)類產(chǎn)品,建議臨用現(xiàn)制,或選擇帶有可控溫樣品室的液相色譜儀進行分析。

表3 33種染發(fā)劑在3個不同濃度水平下的平均加標回收率及其相對標準偏差(n=3)Table 3 Average spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs)of 33 hair dyes at three different concentration levels (n=3)

Nos.are the same as the peak Nos.in Fig.1.

2.8 加標回收率

取9份基質空白樣品,每份0.5 g(精確至0.001 g),分別加入混合標準儲備溶液1.0、2.5、5.0 mL,各3份(相當于待測液中各成分含量為40、100、200 mg/L),按1.3節(jié)方法平行制備待測溶液,進樣5 μL,在1.4節(jié)色譜條件下進行分析。平均回收率及RSDs結果見表3。結果表明,33種成分在40 mg/L水平下的平均回收率為79.2%～116.3%,在100 mg/L水平下的平均回收率為83.1%～110.5%,在200 mg/L水平下的平均回收率為77.6%～113.5%,各濃度下的RSDs值均小于5%。

圖3 6種染發(fā)劑的紫外吸收譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of six hair dyes a.1-hydroxyethyl 4,5-diaminopyrazole sulfate (No.1 in Fig.1);b.tetraaminopyrimidine sulfate (No.2 in Fig.1);c.2-amino-3-hydroxypyridine (No.3 in Fig.1);d.p-phenylenediamine (No.4 in Fig.1);e.4-nitro-o-phenylenediamine (No.25 in Fig.1);f.4-amino-3-nitrophenol (No.26 in Fig.1).

2.9 方法適用性

如圖1所示,按1.4節(jié)色譜條件進行分析時,以下3組成分分別具有相近的保留時間,難以分離:組分1(1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽)和組分2(四氨基嘧啶硫酸鹽);組分3(2-氨基-3-羥基吡啶)和組分4(對苯二胺);組分25(4-硝基鄰苯二胺)和組分26(4-氨基-3-硝基苯酚)。針對上述情況,當樣品在各組保留時間出峰時,需通過圖3所示的各成分紫外吸收特征對色譜峰進行定性,若僅含組內1種成分,則可利用本文方法準確定量;若同時含有組內2種成分,則需建立其他方法進一步分離與定量。

利用國家藥品監(jiān)督管理局數(shù)據(jù)查詢網(wǎng)站,對由20余個國內外廠家生產(chǎn)的90種市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品配方進行統(tǒng)計,未見1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽與四氨基嘧啶硫酸鹽、4-硝基鄰苯二胺與4-氨基-3-硝基苯酚同時在產(chǎn)品中使用的情況,2-氨基-3-羥基吡啶與對苯二胺僅在1批產(chǎn)品中同時使用。因此認為本方法適用于大多數(shù)染發(fā)類產(chǎn)品的檢測。

表4 7批氧化型染發(fā)產(chǎn)品測定結果Table 4 Analytical results of seven batches of oxidative hair dye products

w=content in color cream×mass of color cream/(mass of color cream+mass of developer).

2.10 樣品測定

表4為選取7批配方不同、含染發(fā)劑組分較多的典型氧化型染發(fā)產(chǎn)品進行含量測定的結果,測定結果經(jīng)染發(fā)膏與氧化乳使用比例折算,表中數(shù)據(jù)代表實際使用含量。7批樣品共檢出19種限用染發(fā)劑,實測組分種類均與產(chǎn)品配方一致。其中,5批樣品檢出2.9節(jié)中涉及成分(1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽、四氨基嘧啶硫酸鹽、2-氨基-3-羥基吡啶、對苯二胺),經(jīng)紫外吸收特征判定,未見2種組分同時出峰的情況,因而均可準確定量。

3 結論

利用高效液相色譜同時測定氧化型染發(fā)產(chǎn)品中33種染發(fā)劑的含量,操作簡便、分析快速,具有較高靈敏度與準確性,基本覆蓋了目前氧化型染發(fā)產(chǎn)品中的常用染發(fā)劑成分。從多種產(chǎn)品染發(fā)劑配方組成和樣品實際測定結果看,本方法適用于大多數(shù)氧化型染發(fā)產(chǎn)品的檢測。