陳麗惠, 賈玉珠, 張 斌, 潘秋仁, 陳秦秦, 蔡偉鵬(廈門市疾病預(yù)防控制中心,福建 廈門 361021)

藍(lán)藻毒素是藍(lán)藻代謝過程中產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物,按照毒素作用的靶器官分類,主要有肝毒素、神經(jīng)毒素、皮膚毒素和細(xì)胞毒素等[1]。其中,藍(lán)藻肝毒素包括柱孢藻毒素(CYN)、節(jié)球藻毒素(NOD)和微囊藻毒素(MCs)3大類,常見的微囊藻毒素有MC-RR、MC-YR及MC-LR。藍(lán)藻肝毒素不僅直接污染水體[2,3],還能在淡水生物體內(nèi)產(chǎn)生蓄積[4,5],再通過食物鏈進(jìn)入人體,導(dǎo)致肝臟和腎臟損傷[6],危害公眾健康。因此,建立快速、靈敏、簡便、可靠的藍(lán)藻肝毒素的檢測方法對于保障人民飲食安全具有重要意義。

目前,國內(nèi)外的柱孢藻毒素、節(jié)球藻毒素和微囊藻毒素的檢測方法主要有液相色譜法(LC)[7,8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-12]和鳥槍串聯(lián)質(zhì)譜法[13]。已見報(bào)道的研究主要針對單類藍(lán)藻毒素,未見同時(shí)檢測CYN、NOD和MCs的文獻(xiàn)報(bào)道。魚肉中的CYN、NOD和MCs的前處理方法主要采用固相萃取法[14-16],但其過程繁瑣,消耗溶劑大,分析成本偏高。

分散固相萃取法(DSPE)是2003年美國農(nóng)業(yè)部提出的一種操作簡單、快速、成本低廉的樣品前處理技術(shù)[17],其原理是通過將吸附劑加入到樣品提取液中,吸附干擾雜質(zhì),以達(dá)到凈化樣品的目的。對比傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù),該技術(shù)更為簡便,有效提高了前處理效率,并避免固相萃取中柱子易堵塞的問題，近年來在食品、環(huán)境等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[18-20]。目前,以分散固相萃取法對CYN、NOD和MCs同時(shí)進(jìn)行提取劑凈化的方法未見報(bào)道。

本研究采用分散固相萃取法對魚肉進(jìn)行樣品前處理,著重考察了提取溶劑及吸附劑的種類對提取效率及凈化效果的影響,結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),對淡水魚中CYN、NOD及MCs(MC-RR、MC-YR和MC-LR)進(jìn)行同時(shí)檢測。該方法可為淡水魚中多種藍(lán)藻肝毒素的快速測定提供可靠的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

6460液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);冷凍高速離心機(jī)(德國Sigma公司);KQ-500E型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

CYN、NOD及MCs(MC-RR、MC-YR、MC-LR)標(biāo)準(zhǔn)品由北京曼哈格生物科技有限公司提供;乙腈和甲醇(色譜純,德國Sigma公司);N-丙基乙二胺粉末(PSA,天津博納艾杰爾科技有限公司);C18粉末和酸性氧化鋁粉末(A-AL)(美國Agilent公司);氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

取適量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇配制5種目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中MC-RR、MC-YR、MC-LR及NOD的質(zhì)量濃度為0.4 mg/L,CYN為1.0 mg/L,置于-18 ℃下避光保存。吸取適量上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用空白基質(zhì)提取液稀釋定容,配制成不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品前處理

稱取2.0 g(精確至0.01 g)粉碎均勻的市售鰱魚魚肉樣品,置于30 mL離心管中,加入10 mL乙腈-水-甲酸溶液(89∶10∶1,v/v/v),渦旋振蕩提取3 min,以10 000 r/min低溫離心10 min,取2.0 mL上層清液,置于15 mL玻璃離心管中,加入100 mg C18吸附劑,渦旋混勻1 min,靜置分層,取1.0 mL上清液,加入2.0 mL水,混勻后,過0.22 μm有機(jī)濾膜,待上機(jī)分析測定。

1.3 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,1.8 μm);柱溫為35 ℃;流動相A為水,B為乙腈;流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?～1.0 min,10%B～70%B;1.0～5.0 min,70%B～90%B;5.0～9.0 min,90%B;9.0～9.1 min,90%B～10%B;9.1～15.0 min,10%B。進(jìn)樣體積:10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源:ESI源,負(fù)離子模式;氣流溫度:350 ℃;氣流速度:8 L/min;霧化氣壓力:0.2 MPa;鞘氣(N2)溫度:350 ℃;鞘氣(N2)流速:11 L/min;毛細(xì)管電壓:4 500 V;噴霧電壓:0 V,電子倍增電壓:580 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 柱孢藻毒素、節(jié)球藻毒素、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR和微囊藻毒素-LR的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of cylindrospermopsin (CYN),nodularin (NOD),microcystin-RR (MC-RR),microcystin-YR (MC-YR)and microcystin-LR (MC-LR)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

MCs和NOD在結(jié)構(gòu)上為環(huán)狀多肽,CYN是一種環(huán)類生物堿,均為兩性化合物,在ESI(+)和ESI(-)兩種掃描模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),均能找到相應(yīng)的母離子,因此有必要對其響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行比較,以選擇合適的離子源模式。本實(shí)驗(yàn)考察了1.0 mg/L的5種藍(lán)藻肝毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI(+)和ESI(-)模式下待測物的離子響應(yīng)。以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相,考察5種待測物在ESI(+)模式下的響應(yīng),NOD和MC-RR的響應(yīng)較好,CYN、MC-YR和MC-LR的響應(yīng)較差。同時(shí)考察了在ESI(-)掃描模式下以乙腈-水溶液為流動相時(shí)待測物的響應(yīng),CYN、NOD、MC-YR和MC-LR的離子化效率較在ESI(+)模式下高,但MC-RR的質(zhì)譜響應(yīng)較差。綜上,選擇的離子化模式為ESI(-),與文獻(xiàn)[21-23]報(bào)道相符。

在ESI(-)模式下,以乙腈-水為流動相,對待測物進(jìn)行全掃描以確定各自的母離子,在二級質(zhì)譜掃描中選擇豐度最高的子離子作為定量離子,豐度次之的為定性離子,并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

分別選用Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Phenomenex Luna C18(150 mm×2.0 mm,3 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(50 mm×4.6 mm,1.8 μm)色譜柱進(jìn)行分析,以對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。采用Phenomenex Luna C18色譜柱時(shí),MC-RR、MC-YR和MC-LR存在拖尾現(xiàn)象;采用Waters BEH C18色譜柱時(shí),目標(biāo)化合物的峰形較差;采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱時(shí),MC-RR、MC-YR和MC-LR的色譜峰形及分離度最佳,且與CYN和NOD實(shí)現(xiàn)完全分離。因此,選取Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱對5種藍(lán)藻肝毒素進(jìn)行分離。

考察了采用乙腈-水,乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相時(shí)的分離效果及離子化效率。結(jié)果表明,使用乙腈-水為流動相時(shí),5種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)較高,色譜峰形對稱尖銳。因此本研究選擇乙腈-水作為流動相。圖1為基質(zhì)加標(biāo)樣品中5種目標(biāo)化合物的提取離子色譜圖,目標(biāo)物出峰段雜質(zhì)干擾較小。

圖1 基質(zhì)加標(biāo)樣品中5種化合物(5 μg/L)的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the five compounds (5 μg/L)in matrix spiked samples

圖2 不同提取溶劑對5種化合物回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the five compounds (n=3) A:methanol-formic acid (99∶1,v/v);B:acetonitrile-water (90∶10,v/v);C:methanol;D:acetonitrile-water-formic acid (89∶10∶1,v/v/v).

2.2 分散固相萃取前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

甲醇、甲醇水溶液和乙腈水溶液是提取生物體中藍(lán)藻毒素常用的提取溶劑[24-26],在提取溶液中加入適量甲酸可提高藍(lán)藻毒素的提取效率[27]。因此,本研究考察了采用甲醇、甲醇-甲酸(99∶1,v/v)、乙腈-水(90∶10,v/v)和乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)時(shí)的提取效率(見圖2)。結(jié)果表明，以乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)為提取液時(shí),5種目標(biāo)化合物的回收率為66.0%～97.4%,明顯高于采用乙腈-水(90∶10,v/v)為提取液時(shí)的14.1%～47.9%和采用甲醇-甲酸(99∶1,v/v)時(shí)的61.4%～112.4%,也高于甲醇的22.7%～43.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在提取液中加入1%(v/v)甲酸可明顯提高待測物的提取效率,并有效降低基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮,實(shí)驗(yàn)選擇以乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)為提取溶劑。

2.2.2進(jìn)樣溶劑的優(yōu)化

本方法以乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)作為提取液,發(fā)現(xiàn)提取液提取樣品后直接進(jìn)樣,基質(zhì)效應(yīng)較大,且由于進(jìn)樣溶液與流動相初始比例相差較大,大部分化合物的峰形較差。因此,為減少基質(zhì)效應(yīng),同時(shí)優(yōu)化峰形,可在提取液中加入水進(jìn)行稀釋[26]。本實(shí)驗(yàn)采用在1.0 mL凈化液中加入2.0 mL水進(jìn)行稀釋,使進(jìn)樣溶劑與初始流動相乙腈-水體系更接近,以優(yōu)化峰形。

2.2.3分散固相萃取吸附劑的選擇

分散固相萃取的吸附劑應(yīng)吸附提取液中的主要雜質(zhì)但不吸附待測物,以達(dá)到凈化提取液的目的。C18、PSA和A-AL是常見的分散固相萃取吸附劑,用于吸附魚肉及其他食品中的多種干擾雜質(zhì),起到凈化樣品提取液的作用[28-31]。其中,C18為非極性吸附劑,主要去除脂類和弱極性雜質(zhì);PSA為弱陰離子交換劑,主要去除有機(jī)酸、金屬離子和酚類等[32];A-AL也有一定的脫脂效果,能夠降低基質(zhì)干擾[33]。本實(shí)驗(yàn)比較了C18、PSA和A-AL 3種分散固相萃取吸附劑對魚肉樣品提取液中待測物的凈化回收效果(見圖3)。以A-AL和PSA為吸附劑時(shí),5種待測物的回收率均低于60%,達(dá)不到檢測要求。以C18為吸附劑對魚肉樣品提取液進(jìn)行凈化時(shí),凈化效果及回收率明顯優(yōu)于其他2種吸附劑。因此,本研究選用C18作為分散固相萃取的吸附劑。

圖3 不同吸附劑對5種化合物回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of different sorbents on the recoveries of the five compounds (n=3)PSA:primary secondary amine;A-AL:acidic alumina.

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評估

用乙腈-水-甲酸(89∶10∶1,v/v/v)作為稀釋液配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)取不含待測物的魚肉樣品,按照前處理步驟進(jìn)行提取、凈化,得到空白樣品基質(zhì)溶液,以空白樣品基質(zhì)溶液為稀釋液配制基質(zhì)校準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式,基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的斜率[34],斜率在0.8～1.2之間可認(rèn)為無基質(zhì)效應(yīng),斜率越接近1,表明基質(zhì)效應(yīng)越弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5種待測物的斜率比均低于0.8,表明樣品經(jīng)過分散固相萃取后雖然取得了良好的凈化效果,但仍無法完全消除基質(zhì)效應(yīng),而基質(zhì)效應(yīng)的存在會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,為消除基質(zhì)效應(yīng)干擾,實(shí)驗(yàn)采用相應(yīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.4 方法評價(jià)

2.4.1線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質(zhì)提取液作為稀釋液,配制5種目標(biāo)化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過LC-MS/MS測定后,以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)作圖,繪制基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,5種目標(biāo)化合物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.995 4～0.999 4。以3倍和10倍信噪比計(jì)算得5種目標(biāo)化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果表明,LOD為5～10 μg/kg,LOQ為15～40 μg/kg(見表2)。

表2 5種目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)

y:peak area of quantitative ion;x:mass concentration,μg/L.

2.4.2回收率和精密度

在陰性鰱魚肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度驗(yàn)證。在粉碎后的陰性鰱魚肉樣品中,NOD、MC-RR、MC-YR、MC-LR的低、中、高添加水平為30、60和150 μg/kg,CYN的低、中、高添加水平為75、150和375 μg/kg,按照1.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理,再進(jìn)行LC-MS/MS測定,5種目標(biāo)化合物的回收率為62.3%～101.2%,RSD(n=6)為0.3%～8.6%(見表3)。

表3 5種目標(biāo)化合物的平均回收率與精密度(n=6)Table 3 Average recoveries and precisions of the five target compounds (n=6)

Low,medium and high levels:30,60 and 150 μg/kg for NOD,MC-RR,MC-YR and MC-LR;75,150 and 375 μg/kg for CYN.

2.5 實(shí)際樣品分析

采用本方法對市售11份鯽魚、10份草魚、6份鰱魚及3份野生鯽魚的魚肉樣品中CYN、NOD及MCs(MC-RR、MC-YR、MC-LR)的含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,所有樣品的魚肉均未檢出CYN、NOD及MCs。

3 結(jié)論

本研究建立了分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定淡水魚中柱孢藻毒素、節(jié)球藻毒素和微囊藻毒素的方法。與現(xiàn)有方法相比,該法樣品前處理更為簡便、高效、經(jīng)濟(jì),適用于淡水魚中多種藍(lán)藻肝毒素的快速篩查和準(zhǔn)確定量。