魏莉莉, 薛 霞, 劉艷明, 孫立臻, 程 志, 宿書芳, 趙 寅(山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南 250101)

鏈霉素(streptomycin,STR)和雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin,DHSTR)屬于氨基糖苷類抗生素,對革蘭氏陰性菌有明顯的抗菌活性效果[1],可以預防多種動物疾病。鏈霉素和雙氫鏈霉素能夠有效地治療蜜蜂的腐蛆病[2],在養(yǎng)蜂行業(yè)應用普遍,但由于管理和使用的不科學,常造成蜂產(chǎn)品中該類物質(zhì)的殘留。長期食用鏈霉素和雙氫鏈霉素超標的蜂產(chǎn)品,會對健康產(chǎn)生一定的危害,尤其是聽覺神經(jīng)[3]。因此,國內(nèi)和國際上對蜂產(chǎn)品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的限量值均有相關規(guī)定。我國《綠色食品蜂產(chǎn)品》(NY/T 752-2003)中規(guī)定了鏈霉素的最大殘留限量為20 μg/kg;德國規(guī)定蜂蜜中鏈霉素的限量為20 μg/kg。因此,建立蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素殘留量的先進、高效、準確的檢測方法對維護人類的飲食健康具有重要意義。

目前報道的鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[4]、液相色譜法[5-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-16]。酶聯(lián)免疫法操作相對簡單,但是測定結果的重現(xiàn)性差,準確度低,易造成結果的假陽性或假陰性,常用來進行初篩檢測。鏈霉素和雙氫鏈霉素極性大,分子結構中缺少發(fā)色基團和熒光基團,采用液相色譜法測定時,往往需要對化合物進行柱前或柱后衍生[6]。該方法操作繁瑣,衍生條件要嚴格把控,而且無法有效分離鏈霉素和雙氫鏈霉素,因此不能適應殘留檢測要求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在抗基質(zhì)干擾能力、準確定性和靈敏度等方面具有較強的優(yōu)勢,目前在獸藥殘留檢測方面的應用越來越廣泛?，F(xiàn)有標準方法[9,10]中前處理技術主要采用雙柱串聯(lián)測定蜂產(chǎn)品中的鏈霉素和雙氫鏈霉素,方法復雜,檢驗成本高；為了增加鏈霉素和雙氫鏈霉素的色譜保留行為,在洗脫液或流動相中加入庚烷磺酸鈉等離子對試劑,易污染色譜柱和質(zhì)譜檢測器。因此,凈化方式和色譜保留行為是鏈霉素和雙氫鏈霉素測定的難點。

HLB固相萃取柱是一種通用型的固相萃取柱,在凈化糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等方面有優(yōu)異的性能,常被用作測定食品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的凈化方式之一,但是需要在提取液中加入離子對試劑才能保留。

本研究采用三氯乙酸(TCA)緩沖溶液提取蜂蜜中的鏈霉素和雙氫鏈霉素,采用HLB小柱凈化,經(jīng)親水作用Obelisc R色譜柱分離,MS/MS檢測,避免了離子對試劑的引入,取得了滿意的結果。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Triple Quad 5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧電離(ESI)源)(美國AB Sciex公司);3-18K臺式高速離心機(德國Sigma公司);BT 125D電子天平(德國Sartorius公司);MS3型旋渦混合器(德國IKA公司);SB-800DTD超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國Merck公司);三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、十二水合磷酸氫二鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);鏈霉素標準品(CAS號:3810-74-0,純度96.4%)和雙氫鏈霉素標準品(CAS號:5490-27-7,純度94.4%)均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司;Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司);實驗用水為超純水;實驗用蜂蜜均購自山東省各大超市。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液:準確稱取適量鏈霉素、雙氫鏈霉素標準品,置于10 mL容量瓶中,用水溶解至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液,于-18 ℃避光保存。

混合標準工作液:將標準儲備溶液用水逐級稀釋,配成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標準工作液。

1.3 樣品的制備

無結晶的實驗室樣品：攪拌均勻；有結晶的樣品：在密閉情況下,置于不超過60 ℃的水浴中溫熱,振蕩,待樣品全部溶化后攪拌均勻,迅速冷卻至室溫。

1.4 樣品前處理

1.4.1提取

準確稱取5 g試樣(精確至0.01 g),置于25 mL比色管中,加入10 mL 20 g/L三氯乙酸水溶液(含50 mmol/L磷酸氫二鈉,pH 6.8)渦旋混勻,超聲15 min,取出后,用提取液定容至25 mL,搖勻,得到試樣溶液。將試樣溶液轉移至50 mL具塞離心管中,以8 000 r/min離心5 min,收集上清液待用。若樣品中有少量花粉,可用濾紙過濾,收集濾液待用。

1.4.2凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化Oasis HLB固相萃取柱。準確移取5 mL上清液,以不高于1.0 mL/min的流速全部通過固相萃取柱,棄去濾液;用4 mL超純水分兩次淋洗,棄去淋洗液,將小柱抽干;用1 mL甲酸-乙腈-水(2∶5∶93,v/v/v)洗脫溶液洗脫并收集洗脫液,抽干固相萃取柱。向收集的洗脫液中加入1 mL氨水-乙腈(2∶98,v/v),渦旋混勻后,經(jīng)微孔濾膜過濾,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測定。

基質(zhì)標準工作溶液:取6份空白樣品(5.00±0.02)g,置于25 mL比色管中,按1.4.1節(jié)和1.4.2節(jié)操作制得空白提取液。分別吸取2.5、5、10、25、50和100 μL混合標準工作液,用空白提取液定容至1.0 mL,配成質(zhì)量濃度為2.5、5、10、25、50和100 μg/L系列基質(zhì)標準工作液。

表2 采用4種小柱凈化蜂蜜樣品時STR和DHSTR的回收率Table 2 Recoveries of STR and DHSTR in honey samples cleaned up by four kinds of SPE column

1.5 分析條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:SIELC Obelisc R柱(150 mm×2.1 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為乙腈溶液,B相為0.5%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min,75%A;0.5～3.8 min,75%A～45%A;3.8～5.0 min,45%A;5.0～6.0 min,45%A～10%A;6.0～8.5 min,10%A,8.5～8.6 min,10%A～75%A;8.6～14.0 min,75%A;進樣量:10 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源;離子源溫度:550 ℃;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;掃描方式:正離子模式掃描;電噴霧電壓:5 500 V;霧化器壓力:345 kPa;氣簾氣壓力:138 kPa;輔助氣壓力:345 kPa;碰撞氣壓力:55 kPa;霧化氣、輔助氣：零級空氣；氣簾氣、碰撞氣：高純氮氣。

鏈霉素和雙氫鏈霉素的定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表1。

表1 鏈霉素和雙氫鏈霉素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of streptomycin (STR)and dihydrostreptomycin (DHSTR)

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1凈化方式的選擇

蜂蜜樣品含有大量的果糖和葡萄糖,為了達到去除雜質(zhì)的目的,需要在前處理過程中對目標物進行凈化、富集。固相萃取法由于簡單、快速、高效等特點被廣泛應用于蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素的凈化。本實驗比較了Waters Oasis HLB(60 mg/3 mL)、PRiME HLB(60 mg/3 mL)、MCX(60 mg/3 mL)和WCX(60 mg/3 mL)4種固相萃取柱。4種小柱的凈化方法及鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率見表2。結果表明,采用MCX小柱時目標化合物的回收率最低,主要是因為MCX小柱是混合型強陽離子交換柱,與鏈霉素和雙氫鏈霉素的氨基作用力太強,只用氨水甲醇很難洗脫,文獻[10]報道洗脫需要用30 mL磷酸鹽緩沖液,但是對后續(xù)濃縮造成一定的困難;WCX柱是弱陽離子交換柱,與目標物的氨基作用力相對較弱,回收率有所提高,但是仍不到80%;PRiME HLB柱是一種通過型的固相萃取柱,在凈化磷脂、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)上有出色的性能,但在凈化糖類物質(zhì)方面效果不理想;Oasis HLB柱在去除糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)上有一定的優(yōu)勢,雖不能直接保留目標物,但是借助一定的提取溶劑,兩種化合物均能得到很好地保留,回收率在90%以上。因此,本研究采用Waters Oasis HLB柱作為凈化柱。

圖1 不同提取劑對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on the recoveries of STR and DHSTR Solvent 1:water;solvent 2:50 mmol/L phosphate buffer solution (pH 6.8);solvent 3:20 g/L trichloroacetic acid aqueous solution (including 50 mmol/L phosphate,pH 6.8);solvent 4:50 mmol/L 1-heptanesulfonic acid sodium buffer solution.

2.1.2提取溶劑的選擇

鏈霉素和雙氫鏈霉素屬于堿性化合物,易溶于水,難溶于甲醇、乙腈等有機溶劑,因此常采用緩沖液進行提取[9,10]。食品基質(zhì)中鏈霉素和雙氫鏈霉素的提取溶劑有三氯乙酸溶液、磷酸鹽溶液、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)緩沖溶液等。本實驗考察了水(提取液1)、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)(提取液2)、20 g/L三氯乙酸水溶液(含50 mmol/L磷酸鹽,pH 6.8)(提取液3)和50 mmol/L庚烷磺酸鈉緩沖液[6](提取液4)4種提取溶劑的提取效率(見圖1)。用提取液1和提取液2提取后,鏈霉素和雙氫鏈霉素幾乎無回收,這主要歸因于目標物的極性大,在HLB小柱上基本上無保留。提取液中加入離子對試劑(提取液4)后,目標物與離子對試劑結合,極性變?nèi)?在HLB柱上的保留變強,回收率達到90%以上,但是離子對試劑對色譜柱和質(zhì)譜檢測器會有一定程度的污染。提取液3中加入了三氯乙酸,控制溶液的pH值,回收率也能達到90%以上,作用的原理類似于陽離子交換反相吸附原理。在中性條件下三氯乙酸與目標物的氨基作用,目標物得到保留,增大酸度條件,兩者之間的作用力減弱,被洗脫下來。另一方面,三氯乙酸在一定程度上也可起到沉淀蛋白質(zhì)的作用。因此選擇三氯乙酸作為提取劑。

提取劑中三氯乙酸的濃度和提取液的pH值對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響見圖2。當提取劑中三氯乙酸的質(zhì)量濃度為20 g/L時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率均能達到90%以上,之后再增加三氯乙酸的質(zhì)量濃度,回收率不再明顯增加,因此選取三氯乙酸的質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖2 (a)三氯乙酸的濃度和(b)pH值對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響Fig.2 Effect of (a)mass concentrations of trichloroacetic acid and (b)pH values on the recoveries of STR and DHSTR

隨著提取液pH值的升高,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率逐漸升高,這歸因于pH值升高時三氯乙酸與氫離子的作用力逐漸減弱,而與目標物的氨基作用力逐漸增強。當pH值為6～7時回收率較高且比較穩(wěn)定;當pH值>7時,回收率逐漸下降。因此,提取液的最佳pH值為6～7。

在實際樣品測定中,用20 g/L三氯乙酸水溶液(pH 6.8)提取后,不同蜂蜜樣品之間回收率差別較大,且回收率偏低。對提取后的樣品進行pH值的測定,發(fā)現(xiàn)其pH值在3.5～6.2之間,這是引起回收率偏低的一個重要原因。蜂蜜樣品含有有機酸,而提取液無緩沖能力,因此樣品加入提取液提取后,pH值會發(fā)生變化。為解決此問題,在提取液中加入了磷酸鹽緩沖液。本實驗考察了提取液中加入10、20和50 mmol/L磷酸鹽后,上樣溶液的pH值和樣品的回收率,發(fā)現(xiàn)加入10 mmol/L和20 mmol/L磷酸鹽時緩沖能力不足,仍有部樣品的回收率偏低,而加入50 mmol/L磷酸鹽緩沖效果較好,上樣溶液的pH值穩(wěn)定在6.2～6.7之間。綜合以上因素,將20 g/L三氯乙酸水溶液(含50 mmol/L磷酸鹽,pH 6.8)作為最終的提取溶劑。

2.1.3洗脫溶劑的選擇

考察了洗脫液中甲酸、乙腈和水的體積分別為1 mL+5 mL+94 mL、2 mL+5 mL+93 mL和5 mL+5 mL+90 mL時，鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率。當洗脫液甲酸-乙腈-水的體積分別為1、5和94 mL時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率分別為79.2%和76.8%,回收率偏低;當洗脫液中甲酸-乙腈-水的體積分別為2、5和93 mL時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率分別為93.2%和98.9%,之后再增加甲酸的體積,回收率不再明顯增加,因此選擇甲酸-乙腈-水(2∶5∶93,v/v/v)為最終的洗脫溶劑。

本研究考察了洗脫溶劑分別為0.5、1.0、2.0和3.0 mL時對鏈霉素和雙氫鏈霉素的影響。結果表明,當洗脫溶劑為0.5 mL時,鏈霉素和雙氫鏈霉素均能被完全洗脫,但是相對標準偏差較大;洗脫液用量過多又會導致方法的檢出限偏高。故實驗選擇1.0 mL的洗脫液進行洗脫。

圖3 采用不同色譜柱時鏈霉素和雙氫鏈霉素(100 μg/L)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of STR and DHSTR (100 μg/L)on different chromatographic columns a.column:SIELC Obelisc R column (150 mm×2.1 mm,5 μm);mobile phases:0.5% (v/v)formic acid aqueous solution and acetonitrile;b.column:Waters BEH Amide (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);mobile phases:0.1% (v/v)formic acid aqueous solution containing 5mmol/L ammonium acetate and acetonitrile;c.column:Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);mobile phases:0.1% (v/v)formic acid aqueous solution containing 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile.

2.1.4穩(wěn)定性的考察

用洗脫后的基質(zhì)空白溶液(未添加氨水乙腈)稀釋標準溶液,制備50 μg/L的基質(zhì)標準溶液,分別放置0、6、12、18、24和48 h后測定,與每次臨用前稀釋的鏈霉素和雙氫鏈霉素的基質(zhì)標準溶液(50 μg/L)的響應值進行比較,以兩者的比值(f)考察穩(wěn)定性,f值越小,穩(wěn)定性越差。

結果表明,隨著放置時間的延長,鏈霉素和雙氫鏈霉素的f值均下降,放置48 h后,鏈霉素的f值降為0.52,雙氫鏈霉素的f值降為0.61,說明鏈霉素和雙氫鏈霉素在甲酸-乙腈-水(2∶5∶93,v/v/v)溶液中穩(wěn)定性較差。為解決這一問題,在洗脫后的基質(zhì)空白溶液中加入了1 mL氨水-乙腈(2∶98,v/v)溶液,此時溶液的pH值在4.5左右,用此空白溶液稀釋的基質(zhì)標準溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

鏈霉素和雙氫鏈霉素具有較強的極性和離子特性，在反相C18色譜柱上不保留,必須在流動相中加入離子對試劑來改善目標化合物在C18色譜柱上的保留行為,但是離子對試劑會對質(zhì)譜檢測器造成污染。

本實驗選擇了親水作用色譜柱分析化合物。實驗比較了鏈霉素和雙氫鏈霉素(100 μg/L)在Waters BEH Amide(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters BEH HILIC(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和SIELC Obelisc R (150 mm×2.1 mm,5 μm)3種色譜柱上的保留行為(見圖3)。結果表明,在HILIC色譜柱(見圖3c)上,目標物的響應值偏低且峰形較差;在Amide色譜柱(見圖3b)和Obelisc R(見圖3a)色譜柱上,目標物的響應值無明顯差別,但是經(jīng)過Amide色譜柱分離后目標物的峰寬較寬,且峰形拖尾。因此,本實驗選擇SIELC Obelisc R作為色譜柱。

2.2.2流動相的選擇

SIELC Obelisc R色譜柱是在硅膠表面修飾了羧酸類的官能團,醇類會酯化硅膠表面鍵合的羧酸,影響物質(zhì)的保留時間與重現(xiàn)性,因此本實驗的流動相選用乙腈而不是甲醇。流動相中甲酸的體積分數(shù)影響鏈霉素和雙氫鏈霉素在色譜柱上的保留。本實驗考察了0.2%、0.5%和1.0%(v/v)甲酸水溶液分別作為流動相時對目標物的影響。實驗發(fā)現(xiàn)隨著流動相中甲酸體積分數(shù)的提高,保留時間逐漸縮短,響應值提高,但是當甲酸的體積分數(shù)大于0.5%后,響應值不再顯著變化,且長時間使用酸度較強的流動相也會影響色譜柱的使用壽命。綜合考慮,選擇乙腈-0.5%(v/v)甲酸水作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

鏈霉素和雙氫鏈霉素的結構中含有多個伯胺,具有弱堿性,易被電離成正離子。本實驗采用電噴霧電離源,在正離子掃描模式下對化合物進行母離子掃描,獲得鏈霉素分子離子峰的m/z為582,雙氫鏈霉素分子離子峰的m/z為584;然后以各自的分子離子峰為母離子,對子離子進行二級質(zhì)譜掃描,選取豐度較強、干擾較小的離子為定量和定性離子。在MRM模式下,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

表3 鏈霉素和雙氫鏈霉素的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、LOD和LOQTable 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r),LODs and LOQs of the STR and DHSTR

y:peak area;x:mass concentration,μg/L.

2.4 方法學驗證

2.4.1線性關系和檢出限

對質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、25、50、100 μg/L的系列基質(zhì)標準工作溶液進行測定,獲得標準溶液的色譜圖。以定量離子對的色譜峰面積(y)為縱坐標,以標準工作溶液的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程。對空白樣品加標,以S/N≥3、精密度≤30%為評價依據(jù),確定方法的檢出限為2.0 μg/kg;以S/N≥10、精密度≤21%,回收率范圍60%～120%為評價依據(jù),確定方法的定量限為5.0 μg/kg。鏈霉素和雙氫鏈霉素的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r)、檢出限及定量限見表3。鏈霉素和雙氫鏈霉素在2.5～100 μg/L范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關系,相關系數(shù)均大于0.99,符合方法確證要求。蜂蜜空白樣品和加標樣品(20 μg/kg)的選擇離子流色譜圖見圖4。

圖4 (a)空白蜂蜜和(b)加標蜂蜜(20 μg/kg)樣品的選擇離子流色譜圖Fig.4 Selected ion current chromatograms of (a)blank honey and (b)spiked honey (20 μg/kg)samples

2.4.2回收率與精密度

向空白樣品中分別進行低(5.0 μg/kg)、中(20.0 μg/kg)、高(100.0 μg/kg)3個水平的加標回收試驗,每種加標樣品平行測定6份,考察方法的回收率與精密度。方法的平均回收率為86.9%～113.2%,日內(nèi)和日間精密度小于10%(見表4)。

2.5 基質(zhì)效應(ME)

質(zhì)譜檢測常需要通過基質(zhì)效應評價方法的靈敏度和選擇性。ME=空白基質(zhì)匹配標準溶液的響應值/純?nèi)軇藴嗜芤旱捻憫怠?00%,若ME>100%,表示基質(zhì)效應增強;若ME≈100%,表示無明顯基質(zhì)效應;若ME<100%,表明基質(zhì)效應抑制。本實驗中比較了鏈霉素和雙氫鏈霉素質(zhì)量濃度同為50 μg/L時的基質(zhì)效應,鏈霉素的ME值為90.3%,雙氫鏈霉素的ME值為91.4%。ME值大于90%,表明方法凈化效果良好。

表4 鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations of the STR and DHSTR (n=6)

2.6 實際樣品分析

采用本文建立的方法對山東省各大超市采購的50批次蜂蜜樣品進行分析,其中8批次樣品中檢出鏈霉素,含量為7.2～76.8 μg/kg,雙氫鏈霉素均未檢出。

3 結論

本文建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素的分析方法。該方法有以下優(yōu)點:(1)采用三氯乙酸緩沖溶液提取,HLB固相萃取柱對目標化合物進行凈化,可減少基質(zhì)干擾;(2)親水作用Obelisc R色譜柱分離目標物,與文獻[6,8,9]報道的采用反相色譜柱相比,避免了離子對試劑對色譜柱或質(zhì)譜檢測器的污染;(3)方法的靈敏度高,回收率和精密度均能滿足各類檢測要求,可應用于蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素的批量化檢驗工作的開展。