劉繼斌， 秦小江， 岳 晗， 伊淑賢， 侯曉敏

(山西醫(yī)科大學(xué) 1教務(wù)處， 2公共衛(wèi)生學(xué)院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030001)

吸煙是加速心腦血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究表明，吸煙可增加機(jī)體炎癥水平，導(dǎo)致高血壓、腦血栓和動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生[1-3]。尼古丁(nicotine)作為香煙煙霧的主要毒性成分之一，已被證實(shí)可調(diào)控多種細(xì)胞功能的改變，如誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發(fā)生遷移，通過(guò)影響VSMCs細(xì)胞膜上離子通道的活性和狀態(tài)從而改變血管的緊張性。本研究基于鬼筆環(huán)肽染色法和膠原收縮法觀察尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs舒縮功能的影響，為深入探討尼古丁對(duì)血管功能異常引起的心血管疾病的病理機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重210～230 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(晉) 2017-0001。

2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

尼古丁(Sigma)；鼠尾膠原蛋白I型(杭州生友公司)；羅丹明-鬼筆環(huán)肽(廣州威佳公司)；胎牛血清(Gibco)；L-谷氨酰胺(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)。

3 方法

3.1 大鼠主動(dòng)脈VSMCs的培養(yǎng)及鑒定 首先使用烏拉坦對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，參照文獻(xiàn)[4-6]，用袖套式剝離法去除血管外膜，然后用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜，最終獲得血管平滑肌細(xì)胞層。向培養(yǎng)皿中加入少許含胎牛血清(20%)的培養(yǎng)液，用眼科小剪刀將血管中膜層剪碎成為(1～2) mm×1 mm左右的小組織塊，并將其均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底部。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底朝上并向瓶?jī)?nèi)注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中靜置2 h后，緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)放平。每3～5天換液1次，當(dāng)組織塊周?chē)?xì)胞爬出并大部分組織周?chē)?xì)胞融合至80%以上，進(jìn)行首次傳代，選取第4～6代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用免疫組織化學(xué)方法，使用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

3.2 鬼筆環(huán)肽染色法觀察不同濃度的尼古丁對(duì)大鼠VSMCs收縮功能的影響 將VSMCs用胰蛋白酶消化后，接種于6孔板中，置于孵箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，當(dāng)融合度為50%時(shí)，換含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后將VSMCs分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照(control)組進(jìn)行培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的尼古丁，對(duì)照組加入等量的含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基[6]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

用PBS清洗VSMCs 2次，每次5 min。然后室溫下用4%多聚甲醛固定VSMCs 10 min，PBS清洗VSMCs 3次,每次5 min。5 μL TRITC-鬼筆環(huán)肽貯存液加入150 μL PBS中，配成工作液用于細(xì)胞染色。將6孔板轉(zhuǎn)至暗室中，室溫染色，使用DAPI復(fù)染，PBS沖洗3次，每次10 min。吸去多余水分，封片，共聚焦顯微鏡下分別拍攝不同實(shí)驗(yàn)組的照片，再用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞的表面積(μm2)。

3.3 膠原收縮法觀察不同濃度的尼古丁對(duì)大鼠VSMCs收縮功能影響 依據(jù)上述鬼筆環(huán)肽染色法發(fā)現(xiàn)，尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs的最適刺激濃度為10 μmol/L，因此我們選擇10 μmol/L尼古丁繼續(xù)使用膠原收縮法對(duì)VSMCs收縮情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

向制備好的三維膠原中加入100 μL 10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)皿中。將10 μmol/L尼古丁處理的大鼠主動(dòng)脈VSMCs種植于膠原凝膠中，將培養(yǎng)皿在室溫下放置20 min，待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。然后我們分別觀察加入尼古丁后0 min、10 min、20 min、40 min和60 min時(shí)的膠原收縮情況，對(duì)各個(gè)時(shí)點(diǎn)的膠原面積進(jìn)行拍照，用ImageJ軟件測(cè)量膠原面積。膠原收縮相對(duì)百分比(%)=收縮后膠原面積/收縮前膠原面積×100%。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，利用GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)第4～6天，可見(jiàn)少量細(xì)胞自組織塊邊緣游出，見(jiàn)圖 1A，且形態(tài)多樣，梭形居多。原代培養(yǎng)VSMCs的胞體較小，胞質(zhì)折光性強(qiáng)，10 d左右細(xì)胞顯著增多，高低起伏呈“峰、谷”狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1B。

選擇第3～5代穩(wěn)定生長(zhǎng)的VSMCs作為觀察對(duì)象，經(jīng)特異性的α-SMA免疫組化染色后，高倍鏡下能看到與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的細(xì)胞蛋白肌絲呈陽(yáng)性反應(yīng)，見(jiàn)圖1C。

2 鬼筆環(huán)肽法檢測(cè)尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs收縮能力的影響

分別取0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的尼古丁作用于VSMCs，24 h后固定細(xì)胞，固定細(xì)胞后用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞骨架[7]，計(jì)算細(xì)胞表面積。結(jié)果顯示，0.1 μmol/L的尼古丁作用后無(wú)明顯變化；1 μmol/L的尼古丁作用后VSMCs的肌絲數(shù)量顯著增多，細(xì)胞板狀化明顯；10 μmol/L的尼古丁作用后，VSMCs呈現(xiàn)出較高的張力狀態(tài)，而100 μmol/L尼古丁導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低。分別對(duì)不同組的VSMCs拍攝照片，再用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞的表面積(μm2)，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The primary culture and identification of rat aortic VSMCs. A: rat aorta tissue block; B: primarily cultured rat aortic VSMCs (×10); C: identification of VSMCs by immunocytochemical staining of α-smooth muscle actin (×100).

圖1 大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定

Figure 2. The effect of nicotine on the contraction of rat aortic VSMCs was detected by skeleton staining(×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 利用細(xì)胞骨架染色法檢測(cè)尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞收縮功能的影響

3 膠原收縮法檢測(cè)尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs收縮能力的影響

鑒于前述鬼筆環(huán)肽染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，10 μmol/L是尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs的最適處理濃度，因此在膠原收縮法進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察時(shí)，我們只對(duì)尼古丁選取10 μmol/L濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，將10μmol/L尼古丁處理的VSMCs種植于膠原中，分別在不同時(shí)點(diǎn)(0 min、10 min、20 min、40 min和60 min)進(jìn)行觀察。隨著時(shí)間的增加，膠原收縮逐漸明顯，在60 min時(shí)達(dá)到最大收縮幅度(P<0.01)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明尼古丁對(duì)大鼠血管主動(dòng)脈VSMCs的收縮作用除了具有濃度依賴(lài)性，還具有時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The effect of nicotine on the contraction of rat aortic VSMCs was detected by collagen contraction method. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 min group.

圖3 利用膠原收縮法檢測(cè)尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞收縮功能的影響

討 論

尼古丁是煙草的主要成分之一，已有研究證實(shí)其可以調(diào)控多種細(xì)胞功能的變化[8]、加重腦卒中所致腦損傷等[3, 9]。VSMCs位于動(dòng)脈血管壁的中層，是構(gòu)成血管壁的重要細(xì)胞[10]，對(duì)維持機(jī)體正常功能非常重要，多種刺激因子由于損傷VSMCs而造成相關(guān)的一些心血管疾病，如尼古丁能夠增加活性氧簇和降低一氧化氮的活力等[1]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)的VSMCs經(jīng)不同濃度的尼古丁處理后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)2種不同的實(shí)驗(yàn)方法(鬼筆環(huán)肽法和膠原收縮法)觀察了大鼠血管平滑肌細(xì)胞的舒張收縮功能的變化。

本研究中利用鬼筆環(huán)肽法對(duì)VSMCs骨架進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將大鼠主動(dòng)脈VSMCs用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色后，隨著尼古丁濃度的增加，VSMCs板狀化明顯，肌絲數(shù)量顯著增多，呈現(xiàn)出明顯的收縮狀態(tài)。這種實(shí)驗(yàn)方法雖然可以觀察到尼古丁對(duì)細(xì)胞骨架的影響，但是不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)性的動(dòng)態(tài)觀察，因此我們接下來(lái)又使用了膠原收縮法繼續(xù)對(duì)尼古丁對(duì)VSMCs的收縮作用進(jìn)行了連貫性的觀察。

膠原收縮法是一種間接反映細(xì)胞收縮能力的實(shí)驗(yàn)方法，與鬼筆環(huán)肽染色法類(lèi)似，使用膠原收縮法同樣驗(yàn)證了尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs收縮能力的影響。使用10 μmol/L的尼古丁對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，種植于凝膠中，開(kāi)始作用時(shí)，尼古丁并沒(méi)有對(duì)膠原面積產(chǎn)生明顯影響，作用20 min時(shí)可見(jiàn)膠原呈現(xiàn)顯著收縮，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)作用60 min時(shí)膠原收縮最為顯著。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs的收縮作用不僅與其濃度有關(guān)系，還具有時(shí)間依賴(lài)性。

本研究通過(guò)利用2種不同的實(shí)驗(yàn)方法——細(xì)胞骨架染色法和膠原收縮法，從細(xì)胞水平觀察了尼古丁對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs的收縮作用，為治療尼古丁所致的相關(guān)心血管疾病提供了作用靶點(diǎn)。