多粘菌素B抑制絲狀真菌的定量測(cè)定方法研究

王志新,李昌旺,宏 丹,寧亞維,賈英民

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河北石家莊 050018;2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048)

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一類具有抗菌生物活性小分子多肽物質(zhì)的總稱,具有抑制或殺滅細(xì)菌、真菌以及病毒、腫瘤的能力[1]。天蠶素是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)小分子抗菌肽[2],此后,相繼從昆蟲[3]、植物[4]、微生物[5-6],包括人體[7]中發(fā)現(xiàn)了2000多種抗菌肽。研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽具有抑菌譜廣、抑菌活性高、性質(zhì)穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)良特性,作為抗生素的良好替代品已引起人們極大關(guān)注[1,8]。

目前市面上抗菌肽產(chǎn)品種類眾多,但被批準(zhǔn)使用的較少,其中乳酸鏈球菌素已被批準(zhǔn)用于食品防腐劑[9],短桿菌肽S、多粘菌素B和林蛙抗菌肽可用于制造皮膚軟膏[10-11],那西肽在歐盟和日本被批準(zhǔn)用于飼用添加劑[12]?？咕膽?yīng)用前首先要進(jìn)行功效評(píng)價(jià),然而,由于其來(lái)源廣泛、結(jié)構(gòu)多樣、差異較大,致使其評(píng)價(jià)方法眾多[5,13-15]。在活力評(píng)價(jià)方面,抗菌肽尚未形成統(tǒng)一的評(píng)價(jià)體系或標(biāo)準(zhǔn)方法,導(dǎo)致其定量測(cè)定方法不統(tǒng)一,產(chǎn)品良莠不齊、缺乏可比性,因此亟需建立和完善抗菌肽的活性測(cè)定方法,并制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn),以保證抗菌肽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

關(guān)于抗菌肽抑制細(xì)菌的測(cè)定方法研究較多[5,16],而對(duì)于真菌研究主要集中在酵母菌和植物病原真菌上[10,17],對(duì)引起食品腐敗菌的曲霉菌、青霉菌、毛霉菌等絲狀真菌的研究較少。國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗菌肽抑制真菌能力評(píng)價(jià)方法大多借鑒抗生素的測(cè)定方法,其中應(yīng)用較廣泛的是微生物檢定法,包括微量稀釋法、平板擴(kuò)散法(紙片擴(kuò)散法、管碟法或打孔法)、孢子萌發(fā)抑制法和菌絲生長(zhǎng)抑制法等[14,18-19]。其中較權(quán)威的是《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版第四部)推薦的管碟法和濁度法[20],以及美國(guó)國(guó)家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法M38-A[21]。然而,藥典中評(píng)價(jià)生物活性時(shí),需要以標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)標(biāo)定,而抗菌肽種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,利用標(biāo)準(zhǔn)樣品評(píng)價(jià)時(shí)難度大;而微量稀釋法若采用肉眼觀察判斷渾濁度具有一定誤差,若采用光譜法判讀則受到孢子顏色、大小和形狀的影響,有學(xué)者提議針對(duì)不同指示菌采用不同的判斷依據(jù)[22],但操作起來(lái)更為繁雜,應(yīng)用上具有一定局限性;同時(shí),在進(jìn)行抑制絲狀真菌實(shí)驗(yàn)時(shí),真菌菌體較大且菌絲茂盛,因此,稀釋法和擴(kuò)散法不易獲得準(zhǔn)確結(jié)果,通常采用抑制孢子萌發(fā)和抑制菌絲生長(zhǎng)這2種方法來(lái)衡量抗菌肽對(duì)絲狀真菌的抑制作用。

在方法建立過(guò)程中一般采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行研究,針對(duì)本研究而言,主要考慮的是抗菌肽和指示菌。市面上銷售的抗菌肽產(chǎn)品種類眾多,但是目前常用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有乳酸鏈球菌素、那西肽、桿菌肽、短桿菌肽、多粘菌素等。文獻(xiàn)報(bào)道顯示(表1),對(duì)真菌具有抑制作用的抗菌肽有微生物源抗菌肽(桿菌肽、短桿菌肽S和多粘菌素B)、昆蟲類抗菌肽(天蠶素、昆蟲防御素)以及魚類、兩棲類及哺乳動(dòng)物類抗菌肽。其中報(bào)道較多、使用較廣的為微生物源抗菌肽——桿菌肽、多粘菌素B。多粘菌素B對(duì)真菌和革蘭氏陰性菌均可以產(chǎn)生較好抑菌效果[10,23],桿菌肽對(duì)真菌的抑制作用稍弱于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[24],短桿菌肽S對(duì)真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用較好[25],但近年短桿菌肽S的應(yīng)用逐漸減少。

表1 幾種常見的抗菌肽及其生物活性Table 1 Common antimicrobial peptides and the antimicrobial activities

在抗菌肽抑制真菌中,研究較多的是對(duì)植物病原菌的抑制,其指示菌一般選擇鐮刀菌、立枯絲核菌等[10],但對(duì)引起食品和谷物腐敗或霉變的霉菌研究較少,本研究選擇常用的真菌指示菌——黑曲霉和青霉[33]。由于抗菌肽對(duì)真菌的抗菌方式各不相同,所選的指示菌應(yīng)具有一定代表性,一般選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株或質(zhì)控菌株,綜合考慮,本研究選用標(biāo)準(zhǔn)菌株A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106作為指示菌。

在絲狀真菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇中,文獻(xiàn)報(bào)道大部分采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和察氏培養(yǎng)基[18,34],考慮PDA培養(yǎng)基為天然原料,制備時(shí)成分不穩(wěn)定,而察氏培養(yǎng)基為化學(xué)合成原料,成分穩(wěn)定,因此,測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)考慮重現(xiàn)性等問題,本研究?jī)?yōu)先選擇察氏培養(yǎng)基作為絲狀真菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。因此,本研究以多粘菌素B為抗菌肽研究對(duì)象,以黑曲霉和產(chǎn)黃青霉為指示菌,通過(guò)比較孢子萌發(fā)抑制法和菌絲生長(zhǎng)抑制法篩選抗菌肽抑制絲狀真菌的定量測(cè)定方法,并進(jìn)一步優(yōu)化該方法的最適測(cè)定條件,為解決抗菌肽評(píng)定指標(biāo)不統(tǒng)一、評(píng)價(jià)方式混亂等問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(AspergillusnigerATCC 16404)、產(chǎn)黃青霉(PenicilliumchrysogenumATCC 10106) 本實(shí)驗(yàn)室保存;多粘菌素B(polymyxin B)、桿菌肽 USP級(jí),上海麥克林生化科技有限公司;合成肽(天蠶素Cecropin A、天蠶素Cecropin B、滑爪蟾素Magainin Ⅱ、黑斑側(cè)褶蛙素Esculentin-1A、防御素LL-37) 90%,上海強(qiáng)耀生物科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB) BR級(jí),北京索萊寶生物科技有限公司;一次性平板(Φ=90 mm) 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。

CX31顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社;CD-15AX游標(biāo)卡尺 日本Mitutoyo(三豐)有限公司;Scan1200全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀 法國(guó)Interscience公司;OMP200A分析天平 上海精密儀器有限公司;打孔器 泰州市刁鋪光學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 察氏培養(yǎng)基:氯化鉀0.5 g/L、蔗糖30.0 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、磷酸氫二鉀1.0 g/L、硝酸鈉3.0 g/L、無(wú)水硫酸鎂0.5 g/L和瓊脂20.0 g/L、121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min備用。

1.2.2 指示菌孢子懸液及菌餅制備 孢子懸液制備:取麩皮管中保藏的指示菌接種于察氏培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,用0.5%葡萄糖溶液洗脫孢子,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將孢子懸液調(diào)整至106個(gè)/mL,備用。菌餅制備:將上述制備的孢子懸液,取100 μL涂布于察氏培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng)24～30 h,待菌絲長(zhǎng)滿平板后,用滅菌打孔器自菌落邊緣切取菌餅,備用。

1.2.3 抗菌肽篩選 按照1.2.2的方法制備A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的孢子懸液,并涂布100 μL于察氏培養(yǎng)基,獲得檢測(cè)平板。將多粘菌素B、桿菌肽和5種合成肽分別配制成1 mg/mL的多肽溶液,參照中國(guó)藥典(2015版第四部)抗生素的管碟測(cè)定法[20],在上述制備的檢測(cè)平板上放入牛津杯,每杯添加100 μL多肽溶液,4 ℃預(yù)擴(kuò)散6～10 h,取出放入28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～30 h,測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 多粘菌素B抑制絲狀真菌評(píng)價(jià)方法篩選

1.2.4.1 孢子萌發(fā)抑制法 配制10.00 mg/mL的多粘菌素B溶液,然后分別與1.2.2制備的孢子懸液等體積混合進(jìn)行二倍梯度稀釋,得到多粘菌素B終濃度為0.16、0.31、0.63、1.25、2.50和5.00 mg/mL,然后分別滴加入凹玻片中,架放于帶有淺層水的培養(yǎng)皿中,加蓋保濕,28 ℃培養(yǎng)8～18 h,并以不加多粘菌素B的作對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)觀察3個(gè)以上視野,調(diào)查孢子總數(shù)應(yīng)大于200個(gè),分別記錄各組萌發(fā)情況和孢子總數(shù)(孢子萌發(fā):孢子牙管長(zhǎng)于孢子短半徑)。根據(jù)式(3)[35]計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率,以多粘菌素B濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)幾率值換算表,以相對(duì)抑制率對(duì)應(yīng)的幾率值為縱坐標(biāo),計(jì)算每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度的回歸方程和相應(yīng)的EC50值。

式(1)

式中:R:孢子萌發(fā)率(%);Ng:孢子萌發(fā)數(shù)(個(gè));Nt:孢子總數(shù)(個(gè))。

式(2)

式中:Re:實(shí)驗(yàn)校正孢子萌發(fā)率(%);Rt:實(shí)驗(yàn)組孢子萌發(fā)率(%);R0:對(duì)照組孢子萌發(fā)率(%)。

式(3)

式中:I:孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率(%);R0:對(duì)照組孢子萌發(fā)率(%);Re:實(shí)驗(yàn)校正孢子萌發(fā)率(%)。

1.2.4.2 菌絲生長(zhǎng)抑制法 配制濃度為5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 mg/mL的多粘菌素B溶液,分別取5 mL與冷卻至50 ℃的察氏培養(yǎng)基混勻,培養(yǎng)基中多粘菌素B最終濃度分別為0.17、0.33、0.67、1.00、1.33和1.67 mg/mL。將含有多粘菌素B的察氏培養(yǎng)基倒入平板,每個(gè)平板20 mL,制備含多粘菌素B的平板,以不含多粘菌素B的平板作對(duì)照。參照Chen等[36]的菌絲生長(zhǎng)抑制法加以修改,將含肽平板用打孔器打孔留空,然后將1.2.2中制成的直徑(5.80±0.02) mm的A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106菌餅分別接種于留空處,菌絲面朝上,28 ℃培養(yǎng)。根據(jù)對(duì)照組平板中菌絲生長(zhǎng)情況觀察實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)情況,游標(biāo)卡尺測(cè)量菌絲直徑,每一個(gè)菌落采用十字交叉法垂直測(cè)量各一次,取其平均值。

按照式(5)計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組對(duì)指示菌的生長(zhǎng)抑制率[37],以多粘菌素B濃度的對(duì)數(shù)值及菌絲生長(zhǎng)抑制率對(duì)應(yīng)的幾率值進(jìn)行回歸性分析,計(jì)算多粘菌素B的EC50值。

D(mm)=D1-D2

式(4)

式中:D:菌落增長(zhǎng)直徑(mm);D1:菌落直徑(mm);D2:菌餅直徑(mm)。

式(5)

式中:I:菌絲生長(zhǎng)抑制率(%);D0:對(duì)照組菌落增長(zhǎng)直徑(mm);Dt:實(shí)驗(yàn)組菌落增長(zhǎng)直徑(mm)。

1.2.5 菌絲生長(zhǎng)抑制法的條件研究

1.2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間的研究 按照1.2.4.2的方法制備含肽平板,多粘菌素B在培養(yǎng)基中的濃度分別為0.17、0.33、0.67、1.00、1.33和1.67 mg/mL,分別將直徑(5.80±0.02)mm的兩種絲狀真菌菌餅接種于含多粘菌素B的平板,以不含多粘菌素B的平板作對(duì)照,28 ℃培養(yǎng),分別于36、48、60和72 h測(cè)量菌絲直徑,計(jì)算EC50值。

1.2.5.2 菌餅大小的研究 利用打孔器制備直徑分別為(5.80±0.02)、(8.00±0.02)和(10.00±0.02) mm的兩種絲狀真菌的菌餅,分別接種至1.2.4.2配制的不同濃度的多粘菌素B平板上,以不含多粘菌素B的平板作對(duì)照,28 ℃培養(yǎng),A.nigerATCC 16404于48 h測(cè)量菌絲直徑,P.chrysogenumATCC 10106于72 h測(cè)量菌絲直徑,計(jì)算EC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)平行,數(shù)據(jù)取其平均值,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行絲狀真菌抑制率的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽的選擇

研究7種抗菌肽對(duì)A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的抑制性,結(jié)果見表2。由表2可知,多粘菌素B能夠抑制這兩種指示菌,且抑菌效果好,抑菌圈直徑大于15 mm,因此,本研究的抗菌肽選擇多粘菌素B。

表2 7種抗菌肽對(duì)指示真菌的抑制性Table 2 The antimicrobial activities of 7 kinds of antimicrobial peptides against the indicator fungi

2.2 多粘菌素B抑制絲狀真菌測(cè)定方法的比較

2.2.1 孢子萌發(fā)抑制法 通過(guò)比較孢子萌發(fā)抑制法與菌絲生長(zhǎng)抑制法研究多粘菌素B對(duì)A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),在孢子萌發(fā)抑制法測(cè)定中,采用0.5%葡萄糖培養(yǎng)孢子,對(duì)照組的孢子萌發(fā)率低,約為40%,達(dá)不到測(cè)定方法中要求的90%以上[35],而添加多粘菌素B的實(shí)驗(yàn)組萌發(fā)率更低。有報(bào)道[18]顯示可以采用培養(yǎng)基替代葡萄糖進(jìn)行孢子萌發(fā),基于此,本研究采用PDB培養(yǎng)基進(jìn)行真菌孢子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果顯示,未添加多粘菌素B的對(duì)照組其孢子萌發(fā)率約為80%,而添加多粘菌素B的實(shí)驗(yàn)組的孢子萌發(fā)率均低于對(duì)照組,其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率結(jié)果見表3,回歸性分析見表4。表3顯示,隨著多粘菌素B濃度的增加,A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的孢子萌發(fā)抑制率逐漸增大,對(duì)抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表4),2株菌的卡方均偏大,可見實(shí)際測(cè)定的孢子萌發(fā)抑制率與通過(guò)方程得到的理論值間差異較大。同時(shí),參照農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[35],其在結(jié)果調(diào)查中要求對(duì)照組的孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上,而本實(shí)驗(yàn)未達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)條件。因此,孢子萌發(fā)率法不適合評(píng)價(jià)多粘菌素B對(duì)A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的抑制性。

表3 多粘菌素B對(duì)指示菌孢子萌發(fā)的抑制率Table 3 Inhibition rate of polymyxin B against conidial germination of A.niger and P.chrysogenum strains

表4 多粘菌素B對(duì)指示菌孢子萌發(fā)抑制作用分析Table 4 Analysis the inhibition of polymyxin B against conidial germination of A.niger and P.chrysogenum strains

2.2.2 菌絲生長(zhǎng)抑制法 多粘菌素B對(duì)指示菌菌絲生長(zhǎng)抑制率的結(jié)果見表5。由表5可知,真菌菌絲的生長(zhǎng)均受到多粘菌素B的抑制,隨著多粘菌素B濃度的增大,對(duì)絲狀真菌的抑制作用增強(qiáng),當(dāng)濃度為1.67 mg/mL時(shí),對(duì)2株指示菌的抑制率均在80.00%左右。

表5 多粘菌素B對(duì)指示菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率Table 5 Inhibition rate of polymyxin B against mycelial growth of A.niger and P.chrysogenum strains

根據(jù)多粘菌素B濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)抑制率的幾率值進(jìn)行回歸性及卡方分析,結(jié)果如表6所示。

表6 多粘菌素B對(duì)指示菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用分析Table 6 Analysis the inhibition of polymyxin B against mycelial growth of A.niger and P.chrysogenum strains

對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制法的抑制率進(jìn)行分析,由表6可知,除多粘菌素B對(duì)A.nigerATCC 16404的相關(guān)系數(shù)r較孢子萌發(fā)抑制法的偏小外,其他分析結(jié)果均與孢子萌發(fā)抑制法相差不大或優(yōu)于孢子萌發(fā)抑制法,尤其是其卡方均小于孢子萌發(fā)抑制法的數(shù)值,說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定的數(shù)值與通過(guò)方程得到的預(yù)測(cè)值更為接近,而且多粘菌素B對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用相對(duì)孢子萌發(fā)作用強(qiáng),其EC50均小于1.0 mg/mL?？梢?菌絲生長(zhǎng)抑制法能夠較為準(zhǔn)確地檢測(cè)多粘菌素B的抑菌活性。綜合考慮,本研究選擇菌絲生長(zhǎng)抑制法研究多粘菌素B對(duì)絲狀真菌的活性定量分析。

2.3 A. niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)抑制法的研究

在菌絲生長(zhǎng)抑制性研究中,菌餅的大小在一定程度上反映了真菌的數(shù)量,而培養(yǎng)時(shí)間會(huì)影響菌絲的最終狀態(tài),因此二者均會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和精確性,需要嚴(yán)格控制。

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間的研究 以平板中多粘菌素B濃度為0.33 mg/mL為例,觀察不同培養(yǎng)時(shí)間下A.nigerATCC 16404菌絲生長(zhǎng)的情況(圖1),如圖1所示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌絲開始生長(zhǎng),逐漸向菌餅四周延伸,隨著菌絲的生長(zhǎng),形成的菌落圓且邊緣整齊,易于菌落直徑的測(cè)量。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)含肽平板上A.niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)的影響

統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)時(shí)間下,多粘菌素B對(duì)A.nigerATCC 16404菌絲生長(zhǎng)抑制率的結(jié)果(表7),并進(jìn)行回歸性分析(表8)。

表7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)A.niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響Table 7 Effects of culture time on the inhibition rate of mycelial growth of A.niger ATCC 16404

表8 培養(yǎng)時(shí)間影響A.niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)抑制作用的分析Table 8 Analysis the inhibition of mycelial growth of A.niger ATCC 16404 in different culture time

由表7可知,多粘菌素B的抑菌能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng),呈現(xiàn)先降低后上升的現(xiàn)象,36 h的抑制率最高,其次是72 h,但是二者的相關(guān)系數(shù)r偏小、卡方偏大,說(shuō)明線性回歸性下降,且實(shí)際測(cè)定值與通過(guò)方程得到的理論值偏離較大,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性不高,不適合用于抑菌活性的測(cè)定(表8)。綜合比較48和60 h的分析結(jié)果,48 h的線性關(guān)系和準(zhǔn)確度高,能充分代表此時(shí)抗菌肽的抑菌能力,且減少了時(shí)間和成本投入,因此本研究選擇48 h為最適的培養(yǎng)時(shí)間。在此條件下,多粘菌素B對(duì)A.nigerATCC 16404的EC50為0.61 mg/mL。

2.3.2 菌餅大小對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 不同直徑菌餅的A.nigerATCC 16404菌絲生長(zhǎng)情況見圖2,由圖2可以看出,菌絲圍繞菌餅均勻擴(kuò)展,呈現(xiàn)圓形且邊緣整齊,測(cè)量誤差小。

圖2 菌餅直徑對(duì)含肽平板上A.niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)的影響

不同菌餅直徑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率的結(jié)果見表9,對(duì)抑制率進(jìn)行線性回歸分析,分析結(jié)果見表10。

表9 菌餅大小對(duì)A.niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響Table 9 Effect of mycelium plug diameter on the inhibition rate of mycelial growth of A.niger ATCC 16404

表10 菌餅大小影響A.niger ATCC 16404菌絲生長(zhǎng)抑制作用的分析Table 10 Analysis the inhibition of mycelial growth of A.niger ATCC 16404 with different plug diameter

表9和表10顯示,菌餅直徑對(duì)抑菌率的影響不大,參考卡方與相關(guān)系數(shù)r可知,接種菌餅直徑(8.00±0.02) mm時(shí),線性關(guān)系與精確度都是最佳的,因此選擇(8.00±0.02) mm直徑的菌餅,此時(shí)多粘菌素B對(duì)A.nigerATCC 16404的EC50是0.68 mg/mL。

2.4 P. chrysogenum ATCC 10106菌絲生長(zhǎng)抑制法的研究

2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間的研究 為進(jìn)一步驗(yàn)證菌絲生長(zhǎng)抑制法的可行性,將多粘菌素B用于另一株絲狀真菌P.chrysogenumATCC 10106的抑菌性研究中。研究了多粘菌素B對(duì)P.chrysogenumATCC 10106菌絲生長(zhǎng)抑制的最適培養(yǎng)時(shí)間,其菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)見圖3,菌絲生長(zhǎng)抑制率見表11,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表12。

表11 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)P.chrysogenum ATCC 10106菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響Table 11 Effect of culture time on the inhibition rate of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)含肽平板上P.chrysogenum ATCC 10106菌絲生長(zhǎng)的影響

表12 培養(yǎng)時(shí)間影響P.chrysogenum ATCC 10106菌絲生長(zhǎng)抑制作用的分析Table 12 Analysis the inhibition of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106 in different culture time

由圖3可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),P.chrysogenumATCC 10106菌絲開始從菌餅處向含肽的平板上延伸生長(zhǎng),菌絲生長(zhǎng)均勻致密,便于直徑的測(cè)量。由表11的抑制率數(shù)據(jù)可以看出,抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間先下降后基本穩(wěn)定,48 h時(shí)的抑菌率下降明顯,此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率基本穩(wěn)定。表12的統(tǒng)計(jì)分析顯示,36、72 h的卡方小,準(zhǔn)確性較高,比較這2個(gè)時(shí)間下的相關(guān)系數(shù)r,二者沒有明顯差異(p<0.05),線性回歸性均較好,考慮36 h菌絲生長(zhǎng)量較少,易造成測(cè)量誤差,綜合分析,選擇72 h為合適的培養(yǎng)時(shí)間,此時(shí)多粘菌素B對(duì)P.chrysogenumATCC 10106的EC50是0.67 mg/mL。

2.4.2 菌餅大小對(duì)菌絲生長(zhǎng)情況的影響 不同直徑的P.chrysogenumATCC 10106菌餅在多粘菌素B平板上的生長(zhǎng)情況見圖4,生長(zhǎng)抑制率結(jié)果見表13和表14。

表13 菌餅大小對(duì)P.chrysogenum ATCC 10106菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響Table 13 Effect of mycelium plug diameter on the inhibition rate of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106

表14 菌餅大小影響P.chrysogenum ATCC 10106菌絲生長(zhǎng)抑制作用的分析Table 14 Analysis the inhibition of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106 with different plug diameter

圖4 菌餅直徑對(duì)含肽平板上P.chrysogenumATCC 10106菌絲生長(zhǎng)的影響

圖4顯示,接種菌餅后所形成的菌落較圓且邊緣較整齊,測(cè)量誤差較小。表13表明,隨著菌餅直徑的不斷增大,抑制率逐漸降低;表14表明參考卡方與相關(guān)系數(shù)r可知,在接種菌餅直徑為(5.80±0.02) mm時(shí),線性關(guān)系與準(zhǔn)確度均是最優(yōu)的,因此,選擇(5.80±0.02) mm直徑的菌餅,此時(shí)多粘菌素B對(duì)P.chrysogenumATCC 10106的EC50是0.45 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

在抗菌肽抑制絲狀真菌的活力定量測(cè)定中,本研究發(fā)現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)抑制法較孢子萌發(fā)抑制法更為準(zhǔn)確。目前采用菌絲生長(zhǎng)抑制法進(jìn)行抑菌物質(zhì)活力測(cè)定時(shí),常用于分析的抑菌物質(zhì)多為抗生素[38]、農(nóng)藥殺菌劑[21,37]、中草藥提取物[36]、化學(xué)防腐劑[39]等,用于抗菌肽活力測(cè)定的研究較少,且還未形成相關(guān)的定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)或評(píng)價(jià)方法。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步建立了菌絲生長(zhǎng)抑制法的定量測(cè)定條件:多粘菌素B抑制A.nigerATCC 16404檢測(cè)中,接種(8.00±0.02) mm直徑的菌餅于含多粘菌素B的察氏培養(yǎng)基平板,培養(yǎng)48 h,測(cè)得多粘菌素B的EC50是0.68 mg/mL;多粘菌素B抑制P.chrysogenumATCC 10106研究中,選擇接種的菌餅直徑(5.80±0.02)mm,培養(yǎng)時(shí)間72 h,此時(shí)多粘菌素B的EC50是0.45 mg/mL。本研究通過(guò)控制接種量和培養(yǎng)時(shí)間,保證了測(cè)定方法的精確度與線性回歸性;利用2種絲狀真菌進(jìn)行抑菌方法研究,驗(yàn)證了方法的可行性。