李雅蘭李婷王采集,葛佳麗肖倩文左健趙澤祺雷冠雄張世麗喬月華,*

1徐州醫(yī)科大學(xué)(江蘇221004)

2徐州醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)研究中心（江蘇 221004）

3江蘇省人工聽(tīng)覺(jué)工程實(shí)驗(yàn)室（江蘇221004）

4徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（江蘇221002）

5湘南學(xué)院（湖南423000）

耳鳴(Tinnitus)是在無(wú)任何聲源刺激情況下對(duì)聲音的感知。持續(xù)性或間歇性的耳鳴影響患者的心情，導(dǎo)致患者入睡困難、注意力無(wú)法集中、甚至影響工作和人際關(guān)系等問(wèn)題[1]。目前耳鳴尚無(wú)有效的治療方法，相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。水楊酸鹽是目前用來(lái)建立動(dòng)物耳鳴模型的常見(jiàn)藥物之一[2]。水楊酸鹽誘發(fā)耳鳴常伴有不同程度的聽(tīng)力下降，這種聽(tīng)覺(jué)剝奪引起聽(tīng)皮層的興奮活動(dòng)增強(qiáng)和/或抑制活動(dòng)減弱導(dǎo)致中樞增益增加，神經(jīng)元異?；罨痆3,4]。聽(tīng)皮層過(guò)度興奮可能是耳鳴的主要原因[5-7]，因此聽(tīng)皮層在耳鳴中的研究就顯得尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)焦慮、心理壓力與免疫系統(tǒng)的改變有關(guān)[8]。考慮到耳鳴與心理困擾之間的聯(lián)系，免疫因子在耳鳴中的研究受到關(guān)注。放松訓(xùn)練減輕耳鳴患者的焦慮、壓力等癥狀，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）降低[9]。水楊酸鹽誘導(dǎo)耳鳴動(dòng)物模型中，聽(tīng)覺(jué)中樞中包括TNF-α在內(nèi)的炎癥因子表達(dá)增加[10,11]。TNF阻滯劑依那西普顯著降低小鼠耳蝸水楊酸鹽誘導(dǎo)的耳鳴行為。這些結(jié)果提示，神經(jīng)炎癥可能是耳鳴的一種新機(jī)制，但其確切作用機(jī)理不明[12]。通過(guò)調(diào)節(jié)膜受體的插入和穩(wěn)態(tài)表達(dá)水平,TNF-α影響胞膜和胞內(nèi)的離子通道,從而調(diào)節(jié)突觸傳遞強(qiáng)度。在這些變化中最突出的改變是胞膜AMPA受體（AMPAR,α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體）的表達(dá)[12,13]。然而，TNF-α在耳鳴中的作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)AMPAR表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)尚未見(jiàn)研究。因此，本研究采用長(zhǎng)期腹腔注射水楊酸鹽建立大鼠耳鳴模型，觀察動(dòng)物聽(tīng)皮層中TNF-α和AMPAR的表達(dá)變化，初步探討TNF-α對(duì)耳鳴產(chǎn)生的可能機(jī)制，以期為耳鳴機(jī)制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

使用健康成年雄性Sprague Dawley大鼠24只，清潔級(jí)，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重240-260g，耳廓反射靈敏，均無(wú)噪聲接觸及耳毒性藥物應(yīng)用史。隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，將大鼠保持在12/12小時(shí)黑暗/光照循環(huán)中，不限制飲食和水。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理管理?xiàng)l例規(guī)定。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

水楊酸鹽（美國(guó)Sigma公司），細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），BCA測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔多克隆抗TNF-α抗體（美國(guó)Abcam公司），兔多克隆抗GluA1抗體（美國(guó)Millipore公司），鼠單克隆抗β-actin（美國(guó)Proteintech公司）

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型制備

所有組別的耳鳴模型基于先前的研究[10,14]。24只SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只：Ⅰ、對(duì)照組（200 mg/kg生理鹽水腹腔注射，于上午8時(shí)和下午4時(shí)各注射一次，連續(xù)注射14天）；Ⅱ、慢性注射7天組（200 mg/kg水楊酸鹽腹腔注射，于上午8時(shí)和下午4時(shí)各注射一次，連續(xù)注射7天）；Ⅲ、慢性注射14天組（200 mg/kg水楊酸鹽腹腔注射，于上午8時(shí)和下午4時(shí)各注射一次，連續(xù)注射14天）；Ⅳ、停藥后恢復(fù)14天組（慢性注射水楊酸鹽14天后再停止注射恢復(fù)14天）。所有組別的大鼠分別于造模成功后的第二天上午8時(shí)處死。

1.2.2 驚跳反射抑制（PPI）

耳鳴檢測(cè)參照以往研究[15]。耳鳴檢測(cè)在聲衰減室中進(jìn)行。動(dòng)物感知到耳鳴后，我們采用脈沖前抑制-驚跳反射的方法篩選耳鳴大鼠。測(cè)量不同時(shí)間注射水楊酸或生理鹽水的大鼠前脈沖驚跳刺激的PPI值，進(jìn)行組間比較。

每次實(shí)驗(yàn)中，將大鼠固定在裝有壓力感受器的平臺(tái)上，實(shí)驗(yàn)前先置于65dB SPL白色背景噪聲中適應(yīng)。測(cè)試期間，首先隨機(jī)給予大鼠10次115dB SPL的脈沖刺激，隨后，通過(guò)揚(yáng)聲器隨機(jī)給予30次聲刺激（10次115dB SPL脈沖刺激、10次沒(méi)有前聲的驚跳反射刺激、10次前脈沖驚跳反射刺激）。驚跳刺激的時(shí)間間隔為27-32秒。PPI值為驚跳反射最大幅值減少百分比[（1-PPI/ASR）×100%]。根據(jù)公式 PPI（%）=1-（ASR-PPI）/ASR*100%，計(jì)算前脈沖抑制率。

1.2.3 Western Blot

每組6只大鼠用4%戊巴比妥那（50mg/kg）麻醉后，斷頭取腦迅速分離出聽(tīng)皮層。將20%的組織置于蛋白酶抑制劑和裂解液中勻漿，冰上裂解30 min，4℃ 12000g離心30 min，收集上清，即為總蛋白。將膜蛋白抽提試劑A加入剩余組織中勻漿，冰上裂解20min，4℃ 700g離心10 min，收集上清；上清繼續(xù)4℃14000g離心30 min，吸取上清，即為細(xì)胞漿蛋白；將沉淀下來(lái)的細(xì)胞膜碎片繼續(xù)4℃14000g離心5 min，吸盡上清。加入膜蛋白抽提試劑B，震蕩5s，冰浴10min，同樣操作重復(fù)3次。隨后，4℃14000g離心10 min，收集的上清即為細(xì)胞膜蛋白。使用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白濃度。將提取的總蛋白或膜蛋白樣品加入到預(yù)制的8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離GluA1蛋白質(zhì)(膜蛋白)，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離TNF-α蛋白質(zhì)（總蛋白）。電泳結(jié)束后，用硝化纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉印跡膜2小時(shí)，4℃孵育兔多克隆抗TNF-α（1：1000）、兔多克隆抗GluA1（1：800）和鼠單克隆抗β-actin（1：5000），搖床過(guò)夜。第二天，TBST洗滌3次后，加入一抗種屬特異性熒光標(biāo)記二抗(1：150)室溫下孵育2小時(shí)。TBST洗滌3次后，通過(guò)Odyssey紅外成像系統(tǒng)（美國(guó)Li-COR公司）掃描蛋白條帶。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間均數(shù)差異性比較使用單因素方差分析（Dunnett事后檢驗(yàn)）。TNF-α與GluA1的蛋白表達(dá)采用Pearson相關(guān)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xi s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水楊酸鹽成功誘導(dǎo)了大鼠耳鳴樣行為

本實(shí)驗(yàn)采用了聽(tīng)覺(jué)驚跳反射來(lái)檢測(cè)動(dòng)物的耳鳴樣行為。驚跳反射是骨骼肌對(duì)意想不到的強(qiáng)烈聲刺激的反射性收縮。驚跳刺激之前給予弱的聲刺激或前脈沖刺激時(shí)，動(dòng)物的驚跳反射幅度被減弱，這種現(xiàn)象為前脈沖抑制(PPI)，通過(guò)分析驚跳反射的幅度抑制程度來(lái)對(duì)耳鳴發(fā)生進(jìn)行評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)所用的PPI程序是：在給予驚跳反射刺激前，發(fā)放三種不同強(qiáng)度的前脈沖驚跳刺激75 dB SPL、80 dB SPL和 85dB SPL（分別為 PPI 2，PPI 4和 PPI 8）,并測(cè)量每種強(qiáng)度的前脈沖驚跳刺激所對(duì)應(yīng)驚跳反射的抑制程度。根據(jù)公式，計(jì)算出前脈沖抑制率。不同組別水楊酸鹽注射大鼠的PPI值（xi s）（圖1、表1）。與對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組相比，慢性注射7天組，PPI2、PPI4和PPI8均顯著升高（F=14.278，P=0.002,P＜0.01；F=12.343，P=0.002，P＜0.01；F=5.962，P=0.014，P＜0.05）；慢性注射14天組較對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組，PPI2、PPI4和PPI8均 顯 著 升 高（F=14.278，P=0.000，P＜0.001；F=12.343，P=0.000，P＜0.001；F=5.962，P=0.002，P＜0.01；）；在對(duì)照組、停藥恢復(fù)14天組中，PPI2、PPI4和PPI8無(wú)顯著差異（F=14.278，P=0.175，P＞0.05；F=12.343，P=0.706，P＞0.05；F=5.962，P=0.582，P＞0.05）。前脈沖抑制率越大，驚跳反射被抑制的幅度越小。注射水楊酸鹽后動(dòng)物已耳鳴，耳鳴填補(bǔ)了背景噪聲的間隔，從而減小了前抑制作用。

圖1水楊酸鹽對(duì)前脈沖抑制率的影響。A慢性注射7天組大鼠的PPI反應(yīng)測(cè)定；B慢性注射14天組大鼠的PPI反應(yīng)測(cè)定；C停藥后恢復(fù)14天組大鼠的PPI反應(yīng)測(cè)定；數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；前脈沖刺激：PPI2：75dB SPL；PPI4:80dB SPL；PPI8：85dB SPL(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)Fig.1 Effect of salicylate on pre-pulse inhibition.A The PPI value measured in rats in the chronic(S7)group.B The PPI value measured in rats in the chronic(S14)group.C The PPI value measured in rats in the recovery(S14+R14)group.Results are expressed as mean±SD.Prepulse stimuli:PPI2,75dB SPL;PPI4,80dB SPL;PPI8,85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,respectively)

2.2 TNF-α在聽(tīng)皮層中的表達(dá)

慢性注射7天組、慢性注射14天組與對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組相比，TNF-α蛋白表達(dá)顯著上升（F=5.381，0.727±0.241，P=0.036，P＜0.05；0.820±0.283，P=0.003，P＜0.01）；慢性注射7天組與慢性注射14天組、對(duì)照組與停藥后恢復(fù)14天組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.496，P=0.699，P＞0.05）。（圖2）

圖2各組大鼠聽(tīng)皮層均有TNF-α蛋白的表達(dá)。慢性注射7天組、慢性注射14天組與對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組相比，TNF-α蛋白表達(dá)上升（P=0.036，*P＜0.05；P=0.003，**P＜0.01）(n=6)；對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組，TNF-α蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P=0.699，P＞0.05）(n=6)。Fig.2 Expression of TNF-α was evaluated using western Blot in the auditory cortex.The expression of TNF-α were markedly increased in chronic treatment groups(S7,S14)compared with control group and recovery group(S14+R14)（P=0.036,*P<0.05;P=0.003,**P<0.01,respectively)(n=6).There was no significant difference in TNF-α protein expression between control group and recovery group（P=0.699,P>0.05）(n=6).

2.3 GluA1膜蛋白在聽(tīng)皮層中的表達(dá)

使用亞單位特異性抗體，通過(guò)Western免疫印跡顯示GluA1蛋白的表達(dá)模式（圖3）。慢性注射7天組與對(duì)照組相比，GluA1膜蛋白表達(dá)顯著升高（F=7.602，0.529±0.139，P=0.019，P＜0.05）；與對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組相比，慢性注射14天組GluA1膜蛋白表達(dá)顯著升高（F=7.602，0.730±0.222，P=0.002，P＜0.01）。慢性注射7天組與慢性注射14天組、對(duì)照組與停藥后恢復(fù)14天組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.079，P=0.398，P＞0.05）。

圖3各組大鼠聽(tīng)皮層均有GluA1蛋白的表達(dá)。慢性注射7天組與對(duì)照組相比，GluA1膜蛋白表達(dá)上升（P=0.019，*P＜0.05）(n=6)；慢性注射14天組與對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組相比，GluA1膜蛋白表達(dá)上升（P=0.002，**P＜0.01）(n=6)；對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.398，P＞0.05）(n=6)。Fig.3 Expression of GluA1 in the auditory cortex.Compared with control group,membrane expression of GluA1 in the chronic treatment(S7)group was significantly increased（P=0.019,*P<0.05）(n=6).Membrane expression of GluA1 was significantly upper in the chronic treatment(S14)group compared to the control and recovery group(S14+R14)（P=0.002,**P<0.01）(n=6).There was no significant difference in GluA1 membrane protein expression between control group and recovery group（P=0.398,P>0.05）(n=6).

2.4 TNF-α與GluA1蛋白在聽(tīng)皮層中的相關(guān)性分析

散點(diǎn)圖顯示的是在每個(gè)樣本中的TNF-α蛋白與GluA1膜蛋白的水平（圖4）

表1 行為測(cè)量：不同組別間PPI值比較Table 1 Behavioral testing：Comparisons of PPI values among four groups

圖4大鼠聽(tīng)皮層TNF-α與GluA1蛋白的相關(guān)性注：TNF-α蛋白的表達(dá)與GluA1膜蛋白的表達(dá)在聽(tīng)皮層中成正相關(guān)，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（r=0.710，P=0.000，***P＜0.001）。Fig.4 Correlation between the protein expression of TNF-α and GluA1 in the auditory cortex in rats Note:There was a significantly positive correlation between the protein expression levels of TNF-α and GluA1 in the auditory cortex（r=0.710,P=0.000,***P<0.001）.

3 討論

大劑量水楊酸鹽會(huì)使人和動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的耳鳴感。PPI抑制率增高是動(dòng)物耳鳴的表現(xiàn)[15]。PPI檢測(cè)反映了聽(tīng)覺(jué)信息的快速處理過(guò)程受到高級(jí)認(rèn)知中樞的調(diào)節(jié)[16]。通過(guò)與對(duì)照組相比，水楊酸鹽連續(xù)注射7天、14天組大鼠的PPI抑制率顯著增高，說(shuō)明大鼠感知到耳鳴。但在水楊酸鹽停止注射恢復(fù)14天后大鼠PPI抑制率無(wú)明顯變化，大鼠耳鳴消失。

當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到內(nèi)源或外源性刺激時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中會(huì)產(chǎn)生TNF-α，TNF-α被視作是耳鳴及情緒狀態(tài)的分子標(biāo)志[9,17]。在耳鳴大鼠的中樞聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)里發(fā)現(xiàn)TNF-α基因表達(dá)呈可逆性增加[10,11]。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期注射水楊酸鹽誘導(dǎo)耳鳴大鼠聽(tīng)皮層中TNF-α表達(dá)顯著升高；對(duì)照組、停藥后恢復(fù)14天組，TNF-α的表達(dá)無(wú)顯著差異。此結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致。TNF-α作為一種有效的促炎癥分子，改變神經(jīng)元遞質(zhì)的釋放,調(diào)節(jié)離子通道的表達(dá)，使神經(jīng)元轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮增加和抑制減少，進(jìn)一步影響神經(jīng)可塑性[18]。聽(tīng)皮層過(guò)度興奮是耳鳴的感知基礎(chǔ)，因此TNF-α可能參與聽(tīng)皮層的過(guò)度活躍導(dǎo)致耳鳴產(chǎn)生[10]。

離子型谷氨酸受體AMPAR位于腦中絕大多數(shù)谷氨酸能突觸上，介導(dǎo)大部分興奮性信號(hào)傳遞。AMPAR是同型或異型四聚體復(fù)合物，包含四種相似的GluA1-4亞基組合[19]。在神經(jīng)元活動(dòng)過(guò)程中,TNF-α通過(guò)調(diào)節(jié)表面AMPAR的表達(dá)來(lái)影響突觸傳遞強(qiáng)度，并可能導(dǎo)致興奮毒性[20]。海馬神經(jīng)元中，TNF-α應(yīng)用可使含GluA1亞基的AMPAR表面表達(dá)量增加60%，而這些表面表達(dá)的變化伴隨著AMPAR介導(dǎo)的興奮性突觸后電流的顯著增加[21]。在本次免疫印跡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期水楊酸鹽應(yīng)用的耳鳴大鼠聽(tīng)皮層中GluA1膜蛋白的表達(dá)水平顯著增加。膜蛋白GluA1的增加提示GluA1的過(guò)表達(dá)使插入突觸的同源GluA1/1受體增多，更多的AMPAR向可通透Ca2+的受體轉(zhuǎn)變，Ca2+可滲透的AMPAR（CP-AMPAR）表現(xiàn)出明顯的快速動(dòng)力學(xué)和顯著的多胺敏感性而呈現(xiàn)出內(nèi)向整流，AMPAR發(fā)生鈣內(nèi)流增強(qiáng)了興奮性信號(hào)的傳遞。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α作用于腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）后引起一系列的信號(hào)改變，從而影響AMPAR的表達(dá)導(dǎo)致突觸強(qiáng)度的變化[13]。TNF-α作用于神經(jīng)元TNFR1，通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依賴(lài)性過(guò)程促進(jìn)AMPAR的胞吐作用，改變了突觸AMPAR的分子化學(xué)計(jì)量，使得微型興奮性突觸后電流（mEPSC）的幅度和平均頻率增加，興奮性突觸信號(hào)傳遞增加[22]。TNFR1的激活對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)AMPAR表面表達(dá)的增加是充分且必要的。使用各種蛋白激酶抑制劑以及COX的實(shí)驗(yàn)表明，在TNFR1受體的下游，AMPAR表面表達(dá)增加需要PI3K活性[21]。Hwang等人發(fā)現(xiàn)，在小鼠耳蝸?zhàn)⑸?00mg/kg水楊酸鹽后，TNFR1的mRNA表達(dá)增加[12]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)期水楊酸鹽注射后聽(tīng)皮層中TNF-α和AMPAR的表達(dá)均增加，而且在時(shí)相上兩者有很強(qiáng)的相關(guān)性，故我們推測(cè)TNF-α可能通過(guò)作用于TNFR1，激活下游PI3K途徑，導(dǎo)致胞膜AMPAR插入增多，最終使得表面AMPAR增加，興奮性信號(hào)增強(qiáng)，參與耳鳴大鼠聽(tīng)皮層的過(guò)度活化。

總之，長(zhǎng)期水楊酸鹽應(yīng)用導(dǎo)致大鼠耳鳴，這與聽(tīng)皮層中炎癥因子TNF-α和興奮性受體AMPAR表達(dá)增多有關(guān)。然而，在水楊酸鹽誘導(dǎo)的動(dòng)物耳鳴中，TNF-α表達(dá)與AMPAR變化之間的確切信號(hào)通路過(guò)程還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。