三磷酸腺苷在新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中的釋放機(jī)制

劉斌 李吉平 劉君

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉科（上海200120）

哺乳動物的耳蝸是一個結(jié)構(gòu)復(fù)雜精細(xì)、排列高度有序的聽覺感受器官。耳蝸外側(cè)壁的血管紋是維持內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定非常重要的結(jié)構(gòu)，血管紋的緣細(xì)胞對于維持耳蝸內(nèi)淋巴液中高濃度的K+積聚及內(nèi)外淋巴液中K+的循環(huán)有著重要意義[1]。在耳蝸中，三磷酸腺苷(ATP)是對調(diào)節(jié)聲轉(zhuǎn)導(dǎo)、聽敏度、外毛細(xì)胞主動的機(jī)械放大、耳蝸內(nèi)電位、耳蝸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制血管張力等具有關(guān)鍵作用的信號分子[2]。目前的研究認(rèn)為耳蝸中ATP的主要來源有三種：①血管紋的緣細(xì)胞；②未成熟的耳蝸大上皮嵴的支持細(xì)胞；③成熟耳蝸的支持細(xì)胞[3,4]。陳潔等[5]發(fā)現(xiàn)ATP以囊泡的形式儲存于新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中，并且可向胞外釋放ATP。在我們之前的實驗中[6]，進(jìn)一步證實了ATP以囊泡的形式儲存在緣細(xì)胞的溶酶體中，ATP釋放的量可以被鈣離子依賴的拮抗劑所抑制，在單獨(dú)加入溶酶體膜裂解劑，即溶酶體肽鏈端解酶組織蛋白C(glycyl-L-phenylalanine-3-naphthylamide，GPN)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫耗竭劑-毒胡蘿卜素（TG）后，細(xì)胞外液中ATP的含量增加，而GPN不能使TG處理過的細(xì)胞外液中ATP含量增加，提示緣細(xì)胞胞外ATP釋放與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣庫之間存在相互作用，但是未能闡明具體機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)P2嘌呤受體廣泛表達(dá)于內(nèi)耳組織中，P2Y受體主要分布于內(nèi)外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞和血管紋組織內(nèi)[7]。同時，1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）受體在大鼠耳蝸血管紋中均發(fā)現(xiàn)有表達(dá)[8]。在人類間充質(zhì)干細(xì)胞和分離的胰島細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞外液無鈣離子的環(huán)境中，ATP可以通過P2YR-PLC-IP3觸發(fā)鈣波的釋放[9,10]。國內(nèi)外近期研究發(fā)現(xiàn)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，ATP通過溶酶體胞吐作用釋放至細(xì)胞膜外，從而發(fā)揮生物學(xué)作用，單核細(xì)胞通過鈣依賴性的P2YR-PLC-IP3嘌呤信號系統(tǒng)觸發(fā)溶酶體胞吐作用釋放ATP[11,12]。在單核細(xì)胞中加入TG，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子可以觸發(fā)溶酶體胞吐作用，引起細(xì)胞外液中ATP釋放量增加[12]。在原代培養(yǎng)的緣細(xì)胞中，我們[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入GPN后，標(biāo)記溶酶體胞吐作用的染料FM1-43熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時伴ATP濃度增高，未能闡述鈣離子與ATP釋放機(jī)制之間的關(guān)系。ATP通過作用于P2嘌呤受體參與調(diào)節(jié)耳蝸聽覺生理功能，因此研究ATP在血管紋緣細(xì)胞中的釋放和作用機(jī)制有重要意義。本研究將著重闡述新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中ATP與鈣依賴性的嘌呤信號系統(tǒng)及溶酶體胞吐機(jī)制之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

SD新生大鼠購自中科院上海實驗動物中心，研究方案得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。鈣離子熒光探針Fluo-4AM（貨號S1060）、溶酶體熒光探針(貨號C1046)均購自江蘇碧云天生物有限公司。β-氨基己糖苷酶底物（貨號N9376）購自sigma公司。CellTiter-G10TM（貨號G7571）試劑盒購自promega公司。

1.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)、純化

采用出生1天的SD大鼠，在冰浴無菌DPBS溶液中打開尚未骨化的聽泡壁，完整剝開蝸殼后暴露蝸軸，從底回至頂回撕下整個膜迷路，分離血管紋。具體方案按照我們既往的實驗研究[6]。

1.3 鈣成像

取出培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用不含鈣離子的HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次。先加入0.1μM lysotracker，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30分鐘，溶液量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。再加入2.5μM Fluo 4-AM工作液，與Lysotracker在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱共同孵育30分鐘。除去Fluo 4-AM工作液，用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除殘留的Fluo 4-AM和Lysotracker工作液。然后加入HBSS溶液覆蓋細(xì)胞。37°C培養(yǎng)箱孵育約20-30分鐘。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝影，做熒光染色分析。

1.4 生物發(fā)光法測定ATP濃度

采用CellTiter-G10TM試劑盒，將ATP標(biāo)準(zhǔn)物（Sigma-Aldrich,A6559,USA）10倍稀釋，用酶標(biāo)儀（SpectraMax M2e,Molecular Devices,USA））的LUM模式測定不同ATP濃度時的生物發(fā)光強(qiáng)度，將1×104細(xì)胞接種于96板中過夜，每孔100μl培養(yǎng)液，同時準(zhǔn)備對照孔，只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞；每孔中加入與培養(yǎng)液等體積的混合反應(yīng)液；在混勻器中混勻2 min；將96孔板放置于室溫中10 min，以獲取穩(wěn)定的熒光信號；檢測發(fā)光強(qiáng)度。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出不同處理組中的ATP濃度。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)立3個復(fù)孔。

1.5 β-氨基己糖苷酶釋放率測定

1×104緣細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，吸去培養(yǎng)液并以孵育緩沖液淋洗3遍，每孔加入100μl孵育緩沖液37℃預(yù)孵育10min。分別加入不同濃度受試液100μl或等量的陰性對照（緩沖液），37℃孵育5 min，孵育結(jié)束后冰浴10min終止反應(yīng)，取各孔上清液100μl轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，同時加入100μl底物（p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide(4 mmol/L)，37℃孵育60min，最后加入200μl終止液（200 mmol/L）甘氨酸緩沖液(pH 10.7)）終止反應(yīng)，測定405nm各孔反應(yīng)液吸光度。移去24孔板中各孔剩余上清液，然后每孔加入200μl Triton X-100（0.5%）裂解細(xì)胞，裂解液3000rpm×1min離心，取上清100μl轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，同上操作測定細(xì)胞裂解液中β-氨基己糖苷酶含量。根據(jù)公式計算不同處理組β-氨基己糖苷酶釋放量。β-氨基己糖苷酶釋放量（%）=[上清液吸光度/（上清液吸光度＋細(xì)胞裂解液吸光度）]×100%。每次獨(dú)立實驗重復(fù)三次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究中的數(shù)據(jù)分析采用的是SPSS 26.0 software(IBM SPSS Inc.)，圖像處理所用軟件為Graph-Pad Prism v5.0(GraphPad Software,Inc.);統(tǒng)計學(xué)方法為單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ATP誘導(dǎo)的鈣離子釋放被P2YR-PLC-IP3通路拮抗劑抑制

在原代培養(yǎng)的緣細(xì)胞中，加入30μmol/L ATP后，鈣離子熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，2分鐘時熒光強(qiáng)度最大值(Fmax/F0)為2.379±0.639。在預(yù)先加入非選擇性P2Y嘌呤受體抑制劑100 μmol/L Suramin，再加入30μmol/L ATP后，鈣離子釋放幾乎完全被抑制（Fmax/F0=1.017±.063，P＜0.05），說明ATP誘導(dǎo)的鈣離子依賴于P2Y受體的參與。當(dāng)預(yù)先加入100μmol/L IP3受體拮抗劑2-APB和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫拮抗劑TG后，2-APB組(Fmax/F0=1.01±0.082)和TG組(Fmax/F0=1.02±0.067）鈣離子熒光強(qiáng)度相較于ATP處理組顯著降低(P＜0.05)，而與Suramin組對比無明顯變化，說明在細(xì)胞外液無鈣離子的情況下ATP誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放完全依賴于P2YR-PLC-IP3信號系統(tǒng)作用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘導(dǎo)鈣離子從中釋放。見圖1，圖4。

圖1 ATP誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放可以被P2YR-PLC-IP3通路拮抗劑所抑制Fig.1 ATP-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors.A.ATP誘導(dǎo)緣細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放；B-D ATP誘導(dǎo)的鈣離子釋放可以完全被P2YR-PLC-IP3嘌呤信號受體抑制劑拮抗。A.ATP can evoke Ca2+responses of marginal cells;B-DATP-evoked Ca2+responses can be completely blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors.

2.2 GPN誘導(dǎo)鈣離子熒光強(qiáng)度升高和溶酶體裂解

在加入200 μmol/L GPN 3分鐘后，鈣離子熒光探針（綠色）強(qiáng)度增強(qiáng)，同時溶酶體熒光探針（紅色）染色消失。在GPN的作用下，溶酶體裂解僅用了3分鐘，而鈣離子的反應(yīng)性升高持續(xù)了約15分鐘，說明溶酶體裂解后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放存在促進(jìn)作用。見圖2。

圖2 GPN誘導(dǎo)鈣離子熒光強(qiáng)度升高和溶酶體裂解Fig.2 GPN evoked Ca2+responses and lysosomes lysis.

2.3 GPN誘發(fā)的鈣離子反應(yīng)被P2YR-PLC-IP3通路拮抗劑抑制

在原代培養(yǎng)的緣細(xì)胞中加入200 μmol/L GPN后，鈣離子熒光強(qiáng)度逐漸升高且持續(xù)了約15分鐘，而溶酶體熒光探針染色在3分鐘內(nèi)消失（圖2）。而在預(yù)先分別加入P2YR和IP3受體抑制劑100 μmol/L Suramin和100 μmol/L 2-APB孵育15分鐘，再加入200 μmol/L GPN 3分鐘后，Suramin組(Fmax/F0=1.61±0.23)和2-APB(Fmax/F0=1.640.18)組鈣離子熒光強(qiáng)度相較于單獨(dú)加入GPN組(Fmax/F0=2.46±4.12)顯著降低（P＜0.05），說明P2Y嘌呤受體在GPN誘導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)中起作用，鈣離子反應(yīng)并未完全被抑制。在加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫耗竭劑5μmol/L TG預(yù)先孵育15分鐘，再加入GPN 2分鐘后，鈣離子熒光強(qiáng)度相較于嘌呤受體抑制劑組顯著降低（Fmax/F0=1.32±0.14,P＜0.05），說明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫未被完全拮抗前，溶酶體內(nèi)鈣離子對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放有促進(jìn)作用。見圖3，圖4。

圖3 P2YR-PLC-IP3通路拮抗劑可以抑制GPN誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放Fig.3 GPN-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors

圖4 P2YR-PLC-IP3通路抑制劑對于ATP和溶酶體膜裂解劑（GPN）誘導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)的抑制作用。Fig.4 ATPandGPN-evokedERCa2+responsescanbeblocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors.A：P2YR-PLC-IP3通路抑制劑對于ATP誘導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)的抑制作用，ATP組胞內(nèi)鈣離子釋放濃度顯著強(qiáng)于預(yù)先孵育P2YR-PLC-IP3通路抑制劑組，有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。B：P2YR-PLC-IP3通路抑制劑對于GPN誘導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)的抑制作用，GPN組胞內(nèi)鈣離子釋放濃度顯著強(qiáng)于預(yù)先孵育P2YR-PLC-IP3通路抑制劑組，有統(tǒng)計學(xué)意義·*P＜0.05。預(yù)先孵育Suramin和2-APB組胞內(nèi)鈣離子釋放濃度顯著高于預(yù)先孵育TG組，有統(tǒng)計學(xué)意義**P＜0.05。C:BAPTA-AM對于細(xì)胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)的抑制作用，BAPTA-AM組胞內(nèi)鈣離子釋放濃度顯著低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05。A:ATP-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors,*P<0.05 compared with P2YP-PLC-IP3 inhibitors.B:GPN-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YRPLC-IP3 inhibitors.*P<0.05 compared with P2YR-PLC withP2YR-PLC-IP3inhibitors.**P<0.05comparedwith pre-incubation with Suramin and 2-APB.C:ER Ca2+responses can be blocked by BAPTA-AM,**P<0.05 compared with control.

2.4 緣細(xì)胞中ATP釋放依賴于鈣離子誘導(dǎo)的溶酶體胞吐作用

在加入鈣離子拮抗劑50 μmol/L BAPTA-AM后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度、ATP濃度均降低，說明緣細(xì)胞外ATP的釋放依賴于細(xì)胞內(nèi)的鈣離子。在加入5 μmol/L TG后和200 μmol/L GPN后，ATP釋放量較未處理組顯著升高，TG+GPN處理組（4.67±0.47μmol）較GPN處理組（7.00±0.63μmol）顯著降低（P＜0.05），說明緣細(xì)胞中ATP的釋放量與鈣離子濃度呈正相關(guān)。同時，加入GPN和TG后，β-氨基己糖苷酶釋放率與ATP釋放增高的趨勢相同，說明細(xì)胞外ATP濃度與溶酶體胞吐作用呈正相關(guān)，兩者又與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈正相關(guān)，ATP的釋放依賴于溶酶體的胞吐作用，溶酶體的胞吐作用又依賴于胞內(nèi)鈣離子濃度。見圖4，圖5。

圖5緣細(xì)胞中的ATP和β-氨基己糖苷酶釋放率是鈣依賴性的Fig.5 Release of ATP and β-hexosaminidase are Ca2+dependent in marginal cellsA.ATP在未處理組、TG+GPN組、GPN組和BAPTA-AM組中的釋放量（n=9）。TG+GPN組較未處理組顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05;GPN組較未處理組和TG+GPN組顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義**P＜0.05;BAPTA-AM組較未處理組顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義#P＜0.05。B.β-氨基己糖苷酶在TG、GPN處理因素下的釋放量(n=3)。TG組較對照組顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義*P＜0.05;GPN組較TG組顯著升高，**P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。A.Release of ATP of untreated、TG+GPN and BAPTA-AM(n=9).*P<0.05 compared with untreated;**P<0.05 compared with TG+GPN;#P<0.05 compared with untreated.B.Release of β-hexosaminidase under treatment with TG and GPN.*P<0.05 compared with control;**P<0.05 compared with GPN.

3 討論

在哺乳動物耳蝸中，ATP作為一種神經(jīng)遞質(zhì)廣泛參與了聽覺的形成、蝸內(nèi)電位的產(chǎn)生以及內(nèi)耳中鉀離子的循環(huán)[13]。血管紋在維持耳蝸內(nèi)穩(wěn)態(tài)、產(chǎn)生耳蝸內(nèi)電位（EP）、參與內(nèi)淋巴液形成以及K+的分泌與循環(huán)等方面有著重要作用[14]。作為耳蝸內(nèi)ATP重要的來源之一，關(guān)于緣細(xì)胞的研究，最早由White等[15]用一種ATP特異性結(jié)合染料喹丫因?qū)壖?xì)胞處理后，發(fā)現(xiàn)ATP以囊泡的形式儲存在細(xì)胞中，但未具體闡述是何種細(xì)胞器。在我們之前的研究中[6]發(fā)現(xiàn)，ATP以囊泡的形式儲存在溶酶體，并且在加入溶酶體膜裂解劑后，在電鏡下發(fā)現(xiàn)ATP以囊泡的形式胞吐出細(xì)胞膜，但未能闡明ATP是以何種機(jī)制釋放至細(xì)胞外。在單核細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中，ATP被證實是通過鈣離子依賴性的溶酶體胞吐作用釋放至細(xì)胞外[11,12,16]。在哺乳動物耳蝸中，Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)了一種表達(dá)于細(xì)胞膜的Pannexin1（Panx1）通道，可以作為一種非結(jié)合性的通道釋放ATP，廣泛表達(dá)于耳蝸外側(cè)壁，但在緣細(xì)胞上未發(fā)現(xiàn)其存在。在Zhao等[17]的研究中還發(fā)現(xiàn)耳蝸中存在一種縫隙連接（gap junction），連接于細(xì)胞間，通過在細(xì)胞間釋放IP3進(jìn)而促進(jìn)ATP的釋放，但未在緣細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)表達(dá)。ATP通過P2Y和P2X兩種受體發(fā)揮作用，P2Y和P2X受體在耳蝸中廣泛表達(dá)。在P2Y受體中，P2Y4和P2Y2受體在不同學(xué)者的研究中均認(rèn)為表達(dá)于耳蝸血管紋，尚不清楚是否表達(dá)于緣細(xì)胞[18,19]。在國內(nèi)Liu等[20]的研究中，IP3受體在新生大鼠耳蝸中主要表達(dá)于內(nèi)外毛細(xì)胞和血管紋。

在我們的研究中，當(dāng)加入非選擇性P2嘌呤受體抑制劑Suramin時，ATP誘導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)可被抑制。據(jù)報道，Suramin主要抑制可被ATP和UTP激活的P2Y2受體，而不能抑制P2Y4受體[21]。同樣的現(xiàn)象在間充質(zhì)干細(xì)胞、分離的胰島細(xì)胞中也被發(fā)現(xiàn)，說明ATP誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子釋放依賴于P2Y嘌呤受體的參與[10,22]。然而，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)ATP在平滑肌細(xì)胞中可以通過IP3受體抑制鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放[23]。當(dāng)預(yù)先加入P2YR-PLC-IP3拮抗劑，再加入GPN后，鈣離子熒光強(qiáng)度顯著被抑制；在加入BAPTA-AM(鈣離子拮抗劑)后，鈣離子熒光強(qiáng)度降低的同時，ATP釋放量降低，說明ATP在緣細(xì)胞內(nèi)是以鈣離子依賴的方式釋放。在培養(yǎng)的緣細(xì)胞中預(yù)先加入TG，再加入GPN后，此時鈣離子熒光強(qiáng)度較加入Suramin和2-APB時顯著降低，即當(dāng)TG把內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫耗竭后，GPN不能使TG處理過的緣細(xì)胞外液中ATP含量增加，說明溶酶體在GPN作用后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放具有促進(jìn)作用。鈣離子在細(xì)胞內(nèi)外廣泛存在，在胞內(nèi)主要儲存在酸性細(xì)胞器中包括線粒體、溶酶體和高爾基體中[24]。在成纖維細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)溶酶體儲存的鈣離子在溶酶體裂解后可以通過IP3和蘭尼堿受體觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫進(jìn)一步釋放[25]。蘭尼堿受體廣泛表達(dá)于哺乳動物耳蝸中，在新生和成熟大鼠中，均發(fā)現(xiàn)表達(dá)于血管紋[26,27]。國外近期研究發(fā)現(xiàn)溶酶體作為非標(biāo)準(zhǔn)性鈣庫，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體和蘭尼堿受體釋放鈣離子從而促進(jìn)鈣離子動員信使NAADP（Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate）的產(chǎn)生，作用于溶酶體膜表面的TPCs(two-pore channels)促進(jìn)溶酶體中的鈣離子釋放，釋放至胞質(zhì)中的鈣離子通過作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體和蘭尼堿受體，從而達(dá)到鈣觸發(fā)鈣釋放（CICR）[28]。這與我們在ATP釋放實驗和β-氨基己糖苷酶釋放率實驗中，所觀察到的趨勢相一致，說明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫衰竭后，GPN作用后釋放出的鈣離子不能再對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫起作用。ATP釋放量與溶酶體胞吐作用呈正相關(guān)，前者與鈣離子的熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，目前關(guān)于ATP如何在溶酶體中聚集的機(jī)制尚不明確，國外學(xué)者[29]認(rèn)為ATP可以通過結(jié)合于溶酶體膜上的ATP結(jié)合盒蛋白（ATP-binding-cassette proteins）在質(zhì)子泵的作用下進(jìn)入溶酶體，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Mu?oz等[30]發(fā)現(xiàn)當(dāng)血管紋緣細(xì)胞處于噪聲刺激時，釋放至內(nèi)淋巴的ATP含量增加。在缺氧的Hela細(xì)胞中，ATP儲存于自噬溶酶體中，并通過VAMP7結(jié)構(gòu)依懶性方式釋放至胞外[31]。在缺氧的成骨細(xì)胞中，當(dāng)加入自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤后，胞外ATP的濃度顯著降低，同時激活Caspase3/7介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[32]。目前在國內(nèi)外，尚無關(guān)于耳蝸血管紋緣細(xì)胞在病理狀態(tài)下ATP釋放機(jī)制的研究。

本研究結(jié)果提示：在新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中，細(xì)胞外ATP通過P2YR-IP3-PLC通路觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放，可以促進(jìn)溶酶體的胞吐作用，從而將ATP以囊泡的形式釋放到胞膜外，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。