1800MHz電磁輻射對(duì)大鼠聽性腦干反應(yīng)及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響

羅小莉 鐘時(shí)勛 章碧云 楊紅紅 左汶奇

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，耳鼻咽喉科(重慶400016)

根據(jù)《中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒2018》記載，截止2017年底，中國(guó)手機(jī)用戶已達(dá)到14.17億戶[1]。手機(jī)電磁輻射(Electromagnetic radiation，EMR)造成的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了社會(huì)廣泛關(guān)注。衡量EMR強(qiáng)度的常用指標(biāo)有頻率和比吸收率（Specific absorption rate，SAR）。1800MHz為全球移動(dòng)通信系統(tǒng)常用頻率[2]；而SAR是反應(yīng)手機(jī)EMR被物體吸收的程度，國(guó)際非電離輻射防護(hù)委員會(huì)建議通信頻率下職業(yè)暴露于人體頭部的SAR不應(yīng)超過10w/kg，公眾不應(yīng)超2w/kg[3]。

頭部及耳部是手機(jī)電磁輻射的主要效應(yīng)器官。海馬不僅參與記憶、學(xué)習(xí)、行為調(diào)節(jié)，也參與感覺、嗅、觸覺等信息的加工，有研究證實(shí)海馬不僅是聽覺刺激的響應(yīng)區(qū)，也是聽覺信息傳遞的控制區(qū)，聽覺信息可通過聽覺通路傳遞到海馬CA3區(qū)[4-6]。

有研究表明長(zhǎng)期使用手機(jī)會(huì)增加不孕不育率，引起聽力下降及耳鳴，增加膠質(zhì)瘤和聽神經(jīng)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7-12]。有報(bào)道對(duì)小鼠進(jìn)行間斷3月的手機(jī)EMR其聽性腦干反應(yīng)(Auditory brainstem response，ABR)閾值升高[13]，也有文獻(xiàn)報(bào)道，急性及慢性暴露不會(huì)引起聽力的改變[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞暴露于1800MHz頻率，4w/kg輻射強(qiáng)度下，有自噬小體生成及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變[15]，表明手機(jī)電磁輻射在一定強(qiáng)度和一定條件下，可以引起耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷。

綜上，關(guān)于手機(jī)電磁輻射對(duì)聽覺系統(tǒng)的影響仍存在較大的爭(zhēng)議。在前期離體研究的基礎(chǔ)上，課題組擬在動(dòng)物模型上進(jìn)一步探討手機(jī)電磁輻射對(duì)聽覺系統(tǒng)的慢性和急性損傷，明確手機(jī)電磁輻射引起生物學(xué)效應(yīng)的具體機(jī)制。我們?cè)O(shè)定成年SD大鼠慢性輻射暴露組（1800MHz，2、4w/kg，1h/d，48d）和急性輻射暴露組（1800MHz，2、4、10w/kg，48h），觀察輻射后ABR閾值、活性氧簇(reactive oxygen species ROS)含量及海馬CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)改變等變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取耳廓反射靈敏且ABR≤45dB,無中耳疾病的成年SD大鼠，雌雄不分，體重320-450g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，將篩選后的56只大鼠隨機(jī)分8組，每組7只。具體分組如下：對(duì)照組（Control）：不做任何處理的大鼠；急慢性假輻射組（Sham-A、Sham-C）：置于輻射箱中不開輻射源；2、4w/kg慢性輻射組（E2C、E4C）：暴露于手機(jī)輻射源中每天1小時(shí)，連續(xù)48天；2、4、10w/kg急性輻射組（E2A、E4A、E10A）：暴露于手機(jī)輻射源中連續(xù)48小時(shí)。

1.2 試劑

大鼠ELISA試劑盒（基因美，JYM1051Ra）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

輻射系統(tǒng)組成：輻射源（70MHz-8GHz，National Instruments，USRP-2900，美國(guó)）；功率放大器（最大16w，恒智微波，中國(guó)）；喇叭天線(A-INFO，中國(guó))；輻射系統(tǒng)控制軟件（可按需設(shè)定1800MHz和2-16w的穩(wěn)定輸出功率及時(shí)間，重慶大學(xué)）；自制鐵皮動(dòng)物輻射箱（長(zhǎng)寬高為60、60、80厘米，重慶大學(xué)）；內(nèi)置木箱（長(zhǎng)寬高為40、40、60厘米，重慶大學(xué)）。重慶大學(xué)信息物理社會(huì)可信服務(wù)計(jì)算教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)組裝輻射系統(tǒng)并完成相關(guān)檢測(cè)，頻率與功率均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求；實(shí)驗(yàn)過程中輻射源相關(guān)數(shù)據(jù)持續(xù)發(fā)送至該實(shí)驗(yàn)室，輻射強(qiáng)度及頻率穩(wěn)定符合實(shí)驗(yàn)要求。輻射時(shí)采用軟件控制輻射源，無需人員現(xiàn)場(chǎng)操作，避免了不必要的職業(yè)暴露。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的ABR測(cè)定和取材

ABR閾值測(cè)試儀器采用美國(guó)INTELLEGENT HEARING的誘發(fā)電位儀，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉劑40mg/kg,參考電極置于測(cè)試耳耳廓后，記錄電極置于顱頂，地極置于對(duì)耳耳廓后，刺激聲為tone burst，頻率為4、8、16、24、32KHz，相同刺激強(qiáng)度疊加1024次，最大刺激強(qiáng)度為90dB SPL，依次遞減20dB SPL，快接近閾值時(shí)再以10dB、5dB下降，判斷標(biāo)準(zhǔn)為能重復(fù)出可分辨的ABRⅡ波的最低刺激強(qiáng)度記錄為閾值。

與ABR麻醉方式相同，剖開腹腔，找到腹主動(dòng)脈取血，取血后3000轉(zhuǎn)離心15 min取上清液凍-80℃?zhèn)溆?，以生理鹽水心臟灌注至清亮液體后換為2.5%戊二醛繼續(xù)灌注，待頸僵直后迅速斷頭，取出大腦找到海馬區(qū)切片，確定CA3區(qū)，切塊送透射電鏡。取出的血清離心后的上清液予以ELISA試劑盒（武漢基因美，JYM1052Ra）測(cè)ROS含量了解氧化應(yīng)激程度，在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，加 入 濃 度 為 3000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液各兩孔，待測(cè)樣品孔中加樣品稀釋液與樣品，經(jīng)加酶、溫育、洗滌、顯色、終止后，于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件處理全部數(shù)據(jù)及作圖，ABR與ELISA均采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。

2 結(jié)果

2.1 ABR

Control、Sham-A、Sham-C、E2C、E4C、E2A、E4A、E10A的大鼠在同一頻率（4KHz、8KHz、16KHz、24KHz、32KHz）不同輻射強(qiáng)度下的聽閾差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 ABR聽閾的變化Fig.1 Changes ofABR hearing threshold

2.2 ELISA

采用ELISA法測(cè)定血清ROS水平，對(duì)照組與E4C、E2A、E4A，Sham-C與E2A、E4A，E2C與E2A、E4A，E4C與E4A，Sham-A與E2A、E4A有非常顯著的差異，E10A明顯高于其他各組(P＜0.01)；E4C與Sham-A也有差異（P＜0.05）。在急性輻射組及E4C組中體內(nèi)ROS的升高比其他組更明顯（圖2、表1）。

圖圖2 ROS濃濃度度水水平平Fig.2 Serum ROS levels

2.3 透射電鏡

圖3為CA3區(qū)取材部位。電鏡下見對(duì)照組、Sham-C、Sham-A組大鼠海馬神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)清楚，含量相對(duì)豐富；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)清楚，含量相對(duì)豐富；神經(jīng)髓鞘完整光滑。E2C、E4C、E2A、E4A、E10A組中除E2C組外均可見神經(jīng)元線粒體體積腫脹、嵴減少甚至部分出現(xiàn)空泡樣變，E10A組可見核內(nèi)空泡、線粒體空泡樣變、細(xì)胞核內(nèi)電子密度減低；輻射組除E2C組外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞線粒體體積腫脹、嵴減少甚至部分出現(xiàn)空泡樣變，E10A組細(xì)胞胞漿水腫明顯；輻射組神經(jīng)髓鞘均出現(xiàn)節(jié)段性脫髓鞘改變，髓鞘板層分離，以E4A、E10A組最明顯（圖3、4）。

表1濃度差異對(duì)比表Table 1 Contrast table of concentration difference

圖3 海馬組織CA3區(qū)（B圖甲苯胺藍(lán)染色×50）Fig.3 CA3 area of Hippocampam tissue(B toluidine blue staining×50)

圖4海馬組織超微結(jié)構(gòu)的改變Fig.4 Ultrastructural changes in hippocampus

3 討論

手機(jī)EMR引起的生物學(xué)效應(yīng)目前研究的重點(diǎn)有熱效應(yīng)及非熱效應(yīng)。頭部暴露于EMR的安全限值為2w/kg，大于4w/kg時(shí)可產(chǎn)生熱效應(yīng)，職業(yè)暴露時(shí)達(dá)到了10w/kg，我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)M暴露于1800MHz頻率時(shí)2w/kg、4w/kg、10w/kg的3種狀態(tài)，因引起熱效應(yīng)的器官主要在外部皮膚，人類有顱骨的外部抵擋，能夠穿透顱骨的熱能有限，熱能經(jīng)由顱骨傳達(dá)到大腦內(nèi)部時(shí)熱能減少明顯僅會(huì)引起大腦溫度微弱的升高，故熱效應(yīng)對(duì)腦組織的影響甚微[3,8,16]；過量ROS的產(chǎn)生是引起氧化應(yīng)激非熱效應(yīng)產(chǎn)生的主要機(jī)制[17,18]，ROS的產(chǎn)生主要在線粒體內(nèi)，線粒體是產(chǎn)生三磷酸腺苷的主要產(chǎn)生場(chǎng)所，提供了大部分細(xì)胞生命活動(dòng)所需要的能量，氨基酸、脂肪酸、糖的最終氧化發(fā)生在線粒體，并通過電子傳遞氧化磷酸化過程完成能量轉(zhuǎn)換，ROS水平依賴于ROS生成和消除之間的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)線粒體內(nèi)ROS清除率小于生成率時(shí)，就會(huì)造成ROS的蓄積，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的出現(xiàn)[19-21]。氧化應(yīng)激會(huì)影響細(xì)胞的脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)及DNA等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷或死亡，當(dāng)達(dá)到不能代償程度時(shí)，最終導(dǎo)致正常組織的病變[22-25]。在本研究中，我們推測(cè)E4C、E2A、E4A、E10A組較其他組的ROS含量的升高的原因?yàn)榍耙淮屋椛湓斐傻挠绊懮形聪蛲耆龝r(shí)，就再次暴露于EMR，導(dǎo)致了生物學(xué)效應(yīng)的疊加而出現(xiàn)累積作用，E4C組的SAR值較E2C組高，機(jī)體需要更長(zhǎng)時(shí)間代償輻射對(duì)機(jī)體的影響，累積作用也更明顯。

Galloni[26]報(bào)道暴露于900MHz手機(jī)EMR下大鼠耳蝸外毛細(xì)胞功能未見明顯影響；Mora[27]對(duì)20名健康男性、Gupta[28]對(duì)67名使用手機(jī)超過1年的健康成人行ABR檢查，未見明顯差異；Kayabasoglu[29]對(duì)新生及成年大鼠進(jìn)行EMR，輻射前后的耳聲發(fā)射未見明顯變化。但也有研究指出暴露于手機(jī)EMR下小鼠聽覺皮層甘胺酸受體表達(dá)降低，小鼠ABR閾值有升高，表明手機(jī)EMR對(duì)小鼠聽覺中樞有損傷[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，無論急性暴露組還是慢性輻射組，在2、4、10w/kg輻射強(qiáng)度下ABR的閾值均沒有明顯的改變，這也和部分研究結(jié)果相吻合。聽閾的改變可能與輻射時(shí)間、強(qiáng)度、頻率有一定的聯(lián)系，故我們需要進(jìn)一步延長(zhǎng)模型暴露的時(shí)間。

透射電鏡是觀察細(xì)胞損傷和凋亡的重要手段。神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和單位。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有支持神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成、調(diào)節(jié)信息傳遞、幫助神經(jīng)元存活等功能，大腦中一半以上的細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，有時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)微變化將直接導(dǎo)致疾病。髓鞘是神經(jīng)沖動(dòng)及傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)，并且具有神經(jīng)修復(fù)功能，髓鞘出現(xiàn)病變會(huì)影響神經(jīng)元的功能傳導(dǎo)。上述這些結(jié)構(gòu)對(duì)維持機(jī)體正?；顒?dòng)及抵御病變起到了重要作用。海馬是聽覺信息的重要感知區(qū)，也是大腦內(nèi)介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)之一，故海馬神經(jīng)元組織在氧化應(yīng)激時(shí)極易受損。有文獻(xiàn)報(bào)道暴露于手機(jī)EMR后小鼠與大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量及核直徑均減小，人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)EMR暴露產(chǎn)生了強(qiáng)烈的神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)，小鼠大腦皮層神經(jīng)髓鞘損傷，大鼠心肌細(xì)胞線粒體變性、肌原纖維減少、肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、核周空泡化[14,20,30,31,32]。我們研究發(fā)現(xiàn)，電鏡下E4C、E2A、E4A、E10A組可見神經(jīng)元線粒體與神經(jīng)膠質(zhì)線粒體水腫，并且所有輻射組均可見髓鞘組織的損傷，我們的結(jié)果與Ammari[33]報(bào)道一致，SAR值越大腦組織損害越重。

2011年，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心將射頻輻射列為可能的人類致癌物（2B組）。我們?cè)谳椛浯笫蠛ｑR組織中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與髓鞘的損傷，這些病變是否與聽神經(jīng)瘤及膠質(zhì)瘤等疾病的發(fā)病有關(guān)目前尚無定論，在人類上述腫瘤發(fā)生率的增加均在手機(jī)暴露10年后，我們通過本實(shí)驗(yàn)想檢測(cè)射頻輻射是否能誘發(fā)腦腫瘤，但我們的模型排除了這一假設(shè)，在顯微鏡下，我們無法找到射頻輻射導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的直接證據(jù)。Tang[34]報(bào)道大鼠接受900MHz的電磁場(chǎng)輻射28天，電鏡下海馬組織出現(xiàn)細(xì)胞水腫和神經(jīng)元細(xì)胞器變性，并且大鼠認(rèn)知功能出現(xiàn)損害，而暴露14天的大鼠雖有超微結(jié)構(gòu)改變但認(rèn)知功能改變卻并不明顯，證實(shí)暴露時(shí)間是重要的參考條件。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以做出以下推斷，線粒體損傷的出現(xiàn)早于神經(jīng)細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)缬诎Y狀的出現(xiàn)，這也和人類疾病的發(fā)生規(guī)律相一致。

在該實(shí)驗(yàn)中，我們沒有束縛大鼠活動(dòng)以減少動(dòng)物本身情緒的變化引起的應(yīng)激干擾，我們?cè)O(shè)計(jì)的輻射源在輻射箱底呈均勻的SAR值，大鼠在輻射箱能自由活動(dòng)、進(jìn)食及飲水，這種不是高度標(biāo)準(zhǔn)化的暴露更接近于人類使用移動(dòng)電話時(shí)的真實(shí)狀態(tài)。

綜上，我們認(rèn)為手機(jī)電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制是激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)（即ROS系統(tǒng)），過量生成的ROS可以引起聽覺中樞海馬組織超微結(jié)構(gòu)的損傷，然而動(dòng)物模型聽閾未見明顯的改變，我們推測(cè)可能是超微結(jié)構(gòu)損傷后組織仍處在自我修復(fù)或者代償過程中，或模型暴露的時(shí)間或強(qiáng)度仍不足以導(dǎo)致聽閾改變，故課題組擬進(jìn)行下一步研究來論證。