蔣杰 李雪營 魏學軍

【摘要】目的：比較杜仲不同“發(fā)汗”方法制品中綠原酸的含量，為建立杜仲合理化產(chǎn)地加工標準體系提供科學依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法測定綠原酸含量。結(jié)果：與生品比較：傳統(tǒng)“發(fā)汗”品和其他“發(fā)汗”品中綠原酸含量顯著降低（P﹤0.01）;與傳統(tǒng)“發(fā)汗”品比較，其他“發(fā)汗”品對綠原酸含量的影響均具顯著性差異（P﹤0.01），以60℃烘至半干后“發(fā)汗”品最高，煮后“發(fā)汗”品最低。結(jié)論：采用適宜的其他“發(fā)汗”方法較傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法雖能提高杜仲制品中綠原酸含量，但含量遠低于生品;如臨床應用以綠原酸藥理作用為主時，建議不采用“發(fā)汗”加工方法制品。

【關鍵詞】杜仲;發(fā)汗;綠原酸;含量;高效液相色譜法

【中圖分類號】R283【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0028-03

杜仲藥材由杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的新鮮樹皮加工制備而成，具有補肝腎、強筋骨和安胎的功能，主治肝腎不足引起的腰膝酸軟、筋骨無力，眩暈，妊娠漏血和胎動不安等癥狀，我國西南部和長江中上游等地區(qū)為其主產(chǎn)地[1]。文獻資料表明，其所含綠原酸具有增強機體免疫功能、降血壓、調(diào)血脂、抗疲勞、抗氧化、抗炎抗病毒、利膽和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等廣泛的藥理作用[2-3]，是杜仲廣泛生物活性的重要物質(zhì)基礎。

產(chǎn)地加工是保證藥材質(zhì)量和增強療效的重要技術手段。“發(fā)汗”作為杜仲的一種特殊加工方法，在歷版《中國藥典》均有記載，其方法的科學性在以降壓作用或降壓活性成分（松脂醇二葡萄糖苷）作為評價指標的研究報道中得到驗證[4-5]。本試驗以杜仲綠原酸為評價指標，對其生品、傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法制品和其他“發(fā)汗”方法制品中綠原酸量進行測定和比較，以明確基于杜仲綠原酸生物活性的適宜產(chǎn)地加工方法，為指導其產(chǎn)地加工提供科學的理論依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器Agilent1260InfinityII型液相色譜系統(tǒng)（北京安捷倫公司）;AS10200A型超聲波清洗機（杭州匯爾公司）;DHG-9240A型真空干燥箱（上海金山公司）;METTLER-AE240型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2材料杜仲新鮮樹皮（樣品編號：180518）由都勻市小圍寨鎮(zhèn)杜仲種植園提供，生長期均在15年以上，經(jīng)黔南民族醫(yī)學高等專科學校藥學系中藥教研室李香副教授鑒定為杜仲科植物EucommiaulmoidesOliv.的樹皮。綠原酸標準品（批號：110753-201716，中國食品藥品檢定研究院）;水為超純水;其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1樣品的制備

2.1.1生品（A1）將新鮮樹皮刮去粗皮，曬干后密封儲存。

2.1.2傳統(tǒng)“發(fā)汗”品（A2）取新鮮樹皮刮去粗皮，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時，取出曬干后密封儲存。

2.1.3陰至半干后“發(fā)汗”品（A3）將新鮮樹皮刮去粗皮，于陰涼通風處晾至半干后（3d），將樹皮內(nèi)表面兩兩相對層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時，取出曬干后密封儲存。

2.1.4曬至半干后“發(fā)汗”品（A4）將新鮮樹皮刮去粗皮，曬至半干后（8h），將樹皮內(nèi)表面兩兩相對層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時，取出曬干后密封儲存。

2.1.5[JP2]烘至半干后“發(fā)汗”品（A5）將新鮮樹皮刮去粗皮，于烘箱中60℃（2h）烘至半干后，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時，取出曬干后密封儲存。[JP]2.1.6煮后“發(fā)汗”品（A6）將新鮮樹皮刮去粗皮，于沸水中煮10min后，撈出，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時，取出曬干后密封儲存。

2.1.7蒸后“發(fā)汗”品（A7）將新鮮樹皮刮去粗皮，于籠屜內(nèi)隔水蒸10min（按“圓氣”后計）后，取出，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時，取出曬干后密封儲存。

2.2綠原酸的測定

2.2.1[JP2]色譜條件色譜柱：DiamonsilC18柱（5μm，250mm×4.6mm）;流動相甲醇-1%醋酸水溶液（17：83）;檢測波長：237nm;柱溫：25℃;流速：1.0mL/min;進樣量：20μL。色譜圖見圖1。[JP]

2.2.2供試品溶液的制備[6]取各樣品杜仲藥材約3g，剪成碎片后揉成絮狀，精密稱取1g置具塞錐形瓶中，加入20%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲提取60min后放冷至室溫，用20%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按上操作，各樣品均制備3份供試品溶液，冷藏備用。

2.2.3標準品溶液的制備精密稱取綠原酸標準品一定量，加流動相定容至10mL容量瓶，搖勻后即得0.995mg·mL-1標準品溶液。

2.2.4標準曲線的制備精密移取綠原酸標準品溶液不同體積分數(shù)，按“2.2.1”色譜條件測定，以進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標作標準曲線，得回歸方程為：Y=44.9310X+6.3067，r=0.9999。綠原酸在0.995～19.9μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.5方法學考察取標準品溶液10μL，按“2.2.1”項下方法，連續(xù)測定6次吸光度，峰面積的RSD值為1.63%，說明測量儀器的精密度較高。取標準品溶液10μL，按“2.2.1”項下方法，分別在0、0.5、1、1.5、2、3h測定吸光度，峰面積的RSD值為3.58%，說明綠原酸在3h內(nèi)測定的穩(wěn)定性良好。取A2樣品5份，按“2.2.2”項制備供試品溶液，取供試品溶液10μL，按“2.2.1”項下方法測定，峰面積的RSD值為3.06%，說明方法的重現(xiàn)性良好。取已知含綠原酸量的A2樣品5份，加入適量標準品，按“2.2.2”項制備供試品溶液，取供試品溶液10μL，按“2.2.1”項下方法測定，綠原酸平均回收率為97.67%，RSD值為2.27%，說明該方法的可行性較高。

2.2.6含量測定精密移取各樣品提取所得供試品溶液20μL，按“2.2.1”項下方法操作并計算綠原酸質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表1。

2.3結(jié)果分析

2.3.1與生品（A1）比較傳統(tǒng)“發(fā)汗”品（A2）和其他“發(fā)汗”品（A3-A7）對綠原酸含量的影響均具極顯著性差異（P﹤0.01），降低明顯，尤以煮后“發(fā)汗”品（A6）和蒸后“發(fā)汗”品（A7）為甚。究其原因，主要與綠原酸的性質(zhì)有關：一是熱敏性，高溫下綠原酸的化學結(jié)構極易被破壞，因而煮后“發(fā)汗”品和蒸后“發(fā)汗”品含量極低;二是水解和分子內(nèi)酯基遷移的異構現(xiàn)象，“發(fā)汗”加工時因采用覆蓋物，導致水分氣化速率慢，散失較少，綠原酸發(fā)生水解和分子內(nèi)酯基遷移的異構現(xiàn)象可能性增大，因而含量降低。該試驗結(jié)果驗明，采用“發(fā)汗”加工方法不能提升杜仲生品綠原酸的含量。

2.3.2與傳統(tǒng)“發(fā)汗”品（A2）比較其他“發(fā)汗”品（A3-A7）對綠原酸含量的影響均具極顯著性差異（P﹤0.01）。陰至半干后“發(fā)汗”品（A3）、曬至半干后“發(fā)汗”品（A4）和烘至半干后“發(fā)汗”品（A5）綠原酸含量依次顯著增高;煮后“發(fā)汗”品（A6）和蒸后“發(fā)汗”品（A7）綠原酸含量顯著降低。依次增高的原因是通過采用適當干燥方法使“發(fā)汗”藥材部分水分散失，減少了綠原酸發(fā)生水解和分子內(nèi)酯基遷移的異構現(xiàn)象可能性，三種方法中以烘至半干后“發(fā)汗”水分散失最快。該試驗結(jié)果表明，采用其他“發(fā)汗”加工方法提升傳統(tǒng)“發(fā)汗”加工方法制品中綠原酸含量具有差異化。

3討論

“發(fā)汗”是杜仲的一種傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法，對增強杜仲療效和提升質(zhì)量具有重要意義，其科學性和合理性在杜仲用于降壓的應用中得到驗證。但杜仲作為一種常用中藥材，生物活性廣泛，產(chǎn)生活性的物質(zhì)基礎眾多，除降壓物質(zhì)木質(zhì)素類（主要是松脂醇二葡萄糖苷）外，亦含環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、綠原酸類、杜仲膠和抗真菌蛋白等，具有增強免疫力、降血糖、調(diào)血脂、保肝利膽、利尿、保護神經(jīng)細胞、調(diào)節(jié)骨代謝、補肝護腎、安胎等生物活性[2]，傳統(tǒng)“發(fā)汗”加工方法對上述活性物質(zhì)和生物活性的影響如何，是否均能增強其生物活性，目前未見相關的研究報道。同時，隨著科學技術的進步，對需“發(fā)汗”加工藥材的方法研究呈現(xiàn)多樣性變化[7-8]，對提升“發(fā)汗”藥材的療效和質(zhì)量意義重大，而杜仲“發(fā)汗”新方法的研究亦未見。故選用傳統(tǒng)“發(fā)汗”加工方法的杜仲治療除高血壓癥外其他疾病，存在一定科學性和合理性不足的問題，因而有必要對其不同活性物質(zhì)開展有針對性的“發(fā)汗”加工方法研究。

本試驗以杜仲的活性成分綠原酸為考察指標，測定并比較杜仲生品與不同“發(fā)汗”制品中綠原酸量。結(jié)果表明，杜仲“發(fā)汗”加工制品綠原酸含量均低于生品;其他“發(fā)汗”方法制品與傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法制品綠原酸含量有差異化，適宜的“發(fā)汗”方法可提高傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法綠原酸的含量。該結(jié)果提示，如從綠原酸的量效關系角度評價，杜仲采用“發(fā)汗”加工方法是不科學的?？紤]到“發(fā)汗”藥材的目的除提升質(zhì)量和增強療效外，還有利于生物組織內(nèi)部的微生物和功能酶系促發(fā)資源性化學物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化與化學轉(zhuǎn)化;有利于改善藥材性狀，使之外觀美觀，質(zhì)地致密，香氣味更為濃郁、醇厚;有助于增強或平抑藥材的某一偏性，以達到改變或緩和藥性的目的等作用，因而杜仲采用“發(fā)汗”加工方法是否具有一定的合理性，仍需不斷的深入研究。綜上所述，如臨床應用以杜仲綠原酸的藥理作用為主，就目前《藥典》記載的杜仲加工方法，結(jié)合現(xiàn)有研究的情況，建議不采用“發(fā)汗”加工方法的制品。

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（收稿日期：2018-10-27編輯：劉斌）