硫酸軟骨素眼用膜劑含量測定方法的建立及質(zhì)量研究

崔穎 陳繼成 陳紅艷

【摘要】目的：建立硫酸軟骨素眼用膜劑的含量測定方法并對其進行質(zhì)量研究。方法：優(yōu)化間苯三酚顯色法測定硫酸軟骨素含量，并利用間苯三酚顯色法測定眼用膜劑中硫酸軟骨素含量;評價眼用膜劑的外觀、性狀、pH及重量差異;采用漿法評價其體外釋藥情況;利用Draize眼刺激實驗的改良方法評價眼用膜劑的刺激性;并采用控制變量法考察其穩(wěn)定性。結(jié)果：間苯三酚顯色法最佳條件：濃鹽酸濃度4mol/L，用量，顯色劑用量，煮沸時間，檢測波長，結(jié)果顯示硫酸軟骨素在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度良好。測定硫酸軟骨素眼用膜劑含藥量為0474mg/片，無色透明、柔韌性良好、平整無泡、厚度適宜、pH70。平均重量為372mg;體外釋放結(jié)果顯示具有一定的緩釋作用且無眼部刺激性;但眼用膜劑高溫、高濕條件色澤變黃，含藥量改變。結(jié)論：間苯三酚顯色法可用于測定硫酸軟骨素眼用膜劑含量;自制硫酸軟骨素眼用膜劑外觀，重量差異符合規(guī)定，無眼刺激性，pH符合眼用制劑標準;但對高溫高濕不穩(wěn)定。

【關(guān)鍵詞】硫酸軟骨素;眼用膜劑;間苯三酚法;含量測定;質(zhì)量評價

【中圖分類號】R25621

【文獻標識碼】A

【文章編號】2095-6851（2019）10-040-01

硫酸軟骨素可用于治療角膜炎、角膜潰瘍、化學(xué)灼傷及熱灼傷等角膜損傷。眼用膜劑的應(yīng)用可解決普通的硫酸軟骨素滴眼液的生物利用度較低的問題。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上進一步建立自制硫酸軟骨素眼用膜劑的含量測定方法，并對眼用膜劑的質(zhì)量進行考察。旨在為該類制劑的研究提供更好的理論基礎(chǔ)及實驗參考。

1 儀器與材料

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;超聲波清洗器（深圳市潔盟超聲波清洗機有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義市英峪予華儀器廠）;T6紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;BX1300綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱（上海佐誠實驗儀器有限公司）;RCZ-8B溶出試驗儀（天津市精拓儀器科技有限公司）;硫酸軟骨素（豐足生物有限公司）;聚乙烯醇17-88（天津市開發(fā)區(qū)樂泰化工有限公司）;間苯三酚（天津市光復(fù)精細化工研究所）;冰乙酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠）;甘油（沈陽市華東試劑廠）;注射用水（實驗室自制）;所有試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫酸軟骨素眼用膜劑的制備

稱取300gPVA17-88，用25ml注射用水浸泡24h，70℃恒溫水浴使之溶解。加入甘油200g和硫酸軟骨素150g，攪拌使形成均勻膜漿，將膜漿于70℃恒溫超聲脫氣20min，將膜漿傾倒于經(jīng)過預(yù)處理的玻璃板上，使膜漿在玻璃板上均勻鋪展，并具有一定厚度。將玻璃板置于60℃烘箱中干燥1h，脫膜，在紫外燈下滅菌30 min。將膜劑切割成1cm*05cm的單劑量膜劑。

2.2 間苯三酚顯色法的建立

硫酸軟骨素為酸性粘多糖類物質(zhì)，在酸性條件下加熱水解，可斷裂糖苷鍵，水解產(chǎn)物能夠與間苯三酚反應(yīng)而顯粉紅色，且溶液顏色與硫酸軟骨素濃度在一定范圍內(nèi)符合Lambert-beer定律[1]。故選用該法進行含量測定。

2.2.1 溶液的配制

間苯三酚溶液的配制：稱取250g間苯三酚，用95%乙醇溶液溶解并定容至50mL，得濃度為50mg/mL的間苯三酚乙醇溶液。置入冰箱冷藏待用。

顯色劑的配制：分別吸取間苯三酚乙醇溶液1mL、冰醋酸3mL、4mol/L鹽酸200mL，混勻即得，現(xiàn)用現(xiàn)配。

硫酸軟骨素溶液的配制：精密稱取0500g硫酸軟骨素，純化水溶解并定容至50mL，得濃度為10mg/mL的硫酸軟骨素溶液。

空白輔料溶液的配制：取眼用膜劑處方中除主藥以外的輔料，純化水溶解并定容至50mL，即得。

2.2.2 檢測波長的選擇

分別吸取0mL、010mL、020mL、030mL、040mL硫酸軟骨素溶液及空白輔料溶液04mL于10mL具塞試管中，分別加入300mL顯色劑，用冰醋酸定容，置于100℃沸水中30min。再轉(zhuǎn)移置冰水浴中5min，于400nm～800nm處掃描紫外光譜。結(jié)果硫酸軟骨素水解液在400～800nm波長內(nèi)有兩處吸收峰，分別為44800nm、54450nm。54450nm處吸收峰隨硫酸軟骨素濃度的增大而增大，且空白輔料無干擾。故選擇54450nm處作為檢測波長。

2.2.3 鹽酸濃度的考察

分別用濃度為2mol/L、4mol/L、6mol/L、8mol/L、10mol/L的鹽酸溶液按顯色劑配制操作，按222方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結(jié)果吸光度變化不明顯，當鹽酸濃度為4mol/L時，吸光度較大，且干擾較小。故選擇鹽酸濃度為4mol/L。

2.2.4 鹽酸用量的考察

分別吸取4mol/L鹽酸溶液100mL、200mL、300mL、400mL、500mL配制顯色劑，按222方法方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結(jié)果水解液的吸光度隨鹽酸用量的增大而增大，但是雜質(zhì)干擾也變大。鹽酸用量為100mL時，處吸光度較大且雜質(zhì)干擾較小。故配制顯色劑的鹽酸溶液的適宜用量為100mL。

2.2.5 顯色劑用量的考察

根據(jù)最適鹽酸濃度及用量配制顯色劑，分別用100mL、300mL、500mL的顯色劑對硫酸軟骨素進行水解，按222方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結(jié)果當顯色劑用量為300mL時，吸光度最大，且雜質(zhì)吸收較小。故顯色劑的適宜用量為300mL。

2.2.6 沸水浴時間的考察

分別考察沸水浴時間15min、30min、45min、60min、90min、120min，按222方法于54450nm處測定硫酸軟骨素水解液的吸光度。結(jié)果隨著沸水浴時間的延長，吸光度無明顯變化，而雜質(zhì)干擾明顯增大。沸水浴時間為30min時，吸光度較大且雜質(zhì)干擾小。故選擇沸水浴時間為30min。

2.2.7 標準曲線的繪制

分別吸取硫酸軟骨素溶液010mL、020mL、030mL、040mL、050mL、060mL、070mL，按最佳水解條件測定硫酸軟骨素水解液吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，進行直線回歸，得回歸方程為：y=04520x+01210（R2=09995），線性關(guān)系良好。

2.2.8 精密度

吸取硫酸軟骨素溶液020mL，按按最佳水解條件測定硫酸軟骨素水解液吸光度，每隔兩小時測定一次，連續(xù)測定5次作為日內(nèi)精密度;同法連續(xù)測定5天作為日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度良好，RSD<1%;日間精密度不佳，RSD接近5%，故本法應(yīng)當天樣品當天測定。

2.3 眼用膜劑的質(zhì)量研究

2.3.1 性狀、pH、重量差異及含藥量測定

將21項下制得眼用膜劑按《中國藥典》（2015版）第四部膜劑項下，考察膜劑的性狀、重量差異[2]。另取10片，溶于05mL純化水中，玻璃棒沾取少量溶液，潤濕精密pH試紙，與標準比色卡對比，測其pH。按所建立間苯三酚顯色法測定每片平均含藥量。結(jié)果制得的眼用膜劑無色透明、柔韌性良好、平整無泡、厚度適宜。單片片重范圍為316～428mg，超出重量差異限度的有一片，無超出限度一倍的膜片，符合藥典規(guī)定;pH70。含藥量為0474mg/片

2.3.2 釋放度

按《中國藥典》（2015版）釋放度測定方法第三法小杯法，于第5min，15min，30min，2h，4h分別取樣5mL，同時補充同等體積的釋放介質(zhì)，立即用微孔濾膜濾過，自取樣至濾過應(yīng)在30秒內(nèi)完成[3]。吸取02mL澄清濾液按含量測定方法于5445nm處測定硫酸軟骨素吸光度，計算濃度及累積釋放度，繪制累積釋放曲線。結(jié)果顯示15min釋放不足30%，至2h時接近完全釋放。由此預(yù)測該眼用膜劑較滴眼劑能有效延長藥物于眼部的作用時間。

2.3.3 刺激性

選用健康、無眼疾的家兔，采用左右側(cè)自身對比的方法進行硫酸軟骨素眼用膜劑的單次給藥刺激性試驗，左眼給藥，右眼為空白對照。于給藥后1h，2h，4h，6h，24h，48h，72h后至7天觀察角膜、結(jié)膜、虹膜的受損狀況即眼局部的情況。按照衛(wèi)生部《新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》眼部刺激性試驗反應(yīng)評分表進行評分（該方法為Draize試驗改良的試驗方法）。在此評分系統(tǒng)中，對角膜受損的強度以及面積進行評分，為0～4分。對虹膜進行相關(guān)規(guī)定評分，為0～2分。對結(jié)膜發(fā)炎、水腫、分泌物打分，分別是0～3分，0～4分，和0～3分。刺激性嚴重程度以刺激性最大的家兔為準。按照評分標準得出的評分結(jié)果為2分，刺激性較低。

2.3.4 高溫、高濕試驗

取眼用膜劑150片置于表面皿上，開口，40℃溫度下放置10天，于第五天和第十天取樣，每次取樣量為50片，考察其外觀，含藥量，pH，與第0天進行比較。取眼用膜劑150片于表面皿上，在25℃相對濕度75%條件下放置10天，于第五天和第十天取樣，每次取樣量為50片，按高溫試驗同法進行考察。結(jié)果顯示高溫條件下10天后樣品色澤變?yōu)辄S色，pH無明顯變化，含藥量增加;高濕條件下10天后樣品色澤無明顯變化，pH無明顯變化，含藥量增加。分析硫酸軟骨素可能在高溫、高濕條件下降解為在其最大吸收波長處有吸收的有關(guān)物質(zhì)。

3 討論

硫酸軟骨素眼用膜劑在高溫高濕均條件下均不穩(wěn)定，可能分解為未知的有關(guān)物質(zhì)，有關(guān)物質(zhì)的具體成分還有待考察。故該眼用膜劑應(yīng)該在陰涼干燥處保存，以免發(fā)生降解、變質(zhì)影響治療效果。由于該膜劑為眼用制劑，所以對它的刺激性評價尤為關(guān)鍵，在厚度、柔韌性等方面也有著嚴格要求，避免對眼部造成刺激。膜劑的性狀評價無準確標準，會因?qū)嶒炄藛T的不同而產(chǎn)生較大差異，評價結(jié)果有著很強的主觀因素，會隨著評分人員的不同而產(chǎn)生變化。由于制備者的不同，或者批次的不同對其含量，厚度等方面都會產(chǎn)生影響，因此其質(zhì)量不可控因素較多。

參考文獻：

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