楊溢鐸，李佶，于鑫梅

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海200032)

女性圍絕經(jīng)期是卵巢功能停止前的過(guò)渡時(shí)期，它的本質(zhì)是卵巢功能逐漸下降的過(guò)程，并且是不可逆的。圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型的制備對(duì)于研究絕經(jīng)綜合征、卵巢儲(chǔ)備功能下降及與其相關(guān)的代謝異常疾病、心血管疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病機(jī)制都具有重要的意義。雌二醇(E2)、促卵泡成熟素(FSH)、卵巢功能儲(chǔ)備(AMH)是臨床常用的卵巢功能指標(biāo)。制備圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型的方法有多種，去勢(shì)模型是制備圍絕經(jīng)期的經(jīng)典模型，但去勢(shì)模型大鼠雌激素水平呈斷崖式下降，與正常圍絕經(jīng)期大鼠雌激素水平的大幅度波動(dòng)不一致。我們前期研究認(rèn)為，超促排卵可能導(dǎo)致女性提前出現(xiàn)圍絕經(jīng)期。孕馬血清促性腺激素(PMSG)廣泛用于多種動(dòng)物和家畜的超促排卵，枸櫞酸氯米芬(CC)是目前臨床應(yīng)用最廣泛的促排卵激素。研究[1]發(fā)現(xiàn)PMSG超促排卵后常出現(xiàn)卵巢儲(chǔ)備功能下降。2017年11月～2018年6月，我們采用CC灌胃的超促排卵方法制備圍絕經(jīng)期大鼠模型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 7周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠30只，體質(zhì)量(180±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2013-0016)。1%戊巴比妥鈉；PMSG，批號(hào)：110254564，購(gòu)自寧波第二激素廠；CC，批號(hào)：J0803，購(gòu)自CODAL SYNTO LTD.Cyprus，高特制藥有限公司.塞浦路斯。光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS BX40F4；高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf；-80 ℃超低溫冰箱，Thermo。

1.2 大鼠分組及圍絕經(jīng)期大鼠模型制備方法 30只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為A、B、C、D、E組。A、B組大鼠從動(dòng)情間期開始連續(xù)2天于同一時(shí)間5、10 mg/kg的CC灌胃，間隔2 d不灌胃后重復(fù)同樣操作[2]，共重復(fù)12個(gè)周期。C組大鼠從動(dòng)情間期開始，連續(xù)2 d在同一時(shí)間腹腔注射PMSG 40 IU[1]，間隔2 d不注射后重復(fù)同樣操作，共重復(fù)12個(gè)周期；D組大鼠從動(dòng)情間期開始，連續(xù)2 d于同一時(shí)間灌胃生理鹽水2 mL，間隔2 d后重復(fù)同樣操作，共重復(fù)12個(gè)周期。E組為去勢(shì)對(duì)照組，1%戊巴比妥鈉腹腔注射，待大鼠四肢軟癱后，仰臥位固定于墊巾上，開始腹部備皮，碘伏消毒2遍，從腹部正中線開始依次剪開皮膚、肌層、腹膜后進(jìn)入腹腔，翻開腸管，尋找子宮和卵巢，結(jié)扎子宮角和輸卵管，剪去兩側(cè)卵巢，閉合腹腔。術(shù)后每天肌內(nèi)注射青霉素鈉(劑量25萬(wàn)U/Kg)，連續(xù)3 d，以防感染。

1.3 各組大鼠一般狀態(tài)觀察 12個(gè)周期給藥結(jié)束后觀察A至D組大鼠神態(tài)、毛發(fā)、攝食及活動(dòng)情況。E組在去勢(shì)術(shù)后15 d開始觀察。

1.4 各組大鼠動(dòng)情周期觀察 A至D組從適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始，直至12個(gè)周期給藥結(jié)束后30 d，每日進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片。陰道涂片采用巴氏吸管吸取0.9%生理鹽水0.2 mL，在陰道口反復(fù)沖洗大鼠陰道2～3次，然后將沖洗后的生理鹽水均勻滴在載玻片上，晾至半干，置于95%酒精中固定30 min，經(jīng)HE染色，在光鏡下觀察陰道上皮脫落細(xì)胞的情況，并記錄動(dòng)情周期。E組在去勢(shì)術(shù)后15 d開始連續(xù)15 d行陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察并記錄大鼠動(dòng)情周期。

1.5 各組大鼠血清E2、FSH、AMH水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)。給藥結(jié)束后30 d，1%戊巴比妥鈉麻醉A、B、C、D組大鼠，行腹主動(dòng)脈采血，E組去勢(shì)手術(shù)30 d后行腹主動(dòng)脈采血，離心后，分離上層血清。按照試劑盒說(shuō)明用ELISA法測(cè)算各組大鼠血清E2、FSH、AMH水平。重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)觀察 采用HE染色。給藥結(jié)束后15 d，1%戊巴比妥鈉麻醉A、B、C、D組大鼠，剖腹取下雙側(cè)卵巢，去除卵巢周圍脂肪后置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規(guī)HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織的病理形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 A組大鼠精神欠振，毛發(fā)略黃，毛發(fā)欠光澤，毛發(fā)脫落較少，飲水及飲食量輕度減少，活動(dòng)度輕度減少；B組大鼠情緒略躁動(dòng)，毛發(fā)暗黃，光澤度降低，毛發(fā)脫落較少，飲水及飲食量輕度減少，活潑度輕度減少；C組大鼠精神欠振，毛發(fā)暗黃，無(wú)光澤度，毛發(fā)脫落較多，飲水及飲食量輕度減少，活動(dòng)度明顯減少；D組大鼠精神基本正常，毛發(fā)光澤，毛發(fā)脫落較少，飲水及飲食量正常，活潑好動(dòng)；E組大鼠精神抑郁寡歡，毛發(fā)暗黃，無(wú)光澤，毛發(fā)脫落較多，飲水及飲食量明顯減少，活動(dòng)性明顯降低，嗜睡喜臥。

2.2 各組大鼠動(dòng)情周期比較 A組從給藥的第5個(gè)周期開始，動(dòng)情周期開始不規(guī)律，主要表現(xiàn)為動(dòng)情后期的延長(zhǎng)和動(dòng)情周期各階段出現(xiàn)的順序發(fā)生改變，隨著給藥次數(shù)的增多，每個(gè)給藥周期內(nèi)，動(dòng)情期的出現(xiàn)開始延遲，甚至消失，最終從第9個(gè)周期開始呈現(xiàn)出持續(xù)的動(dòng)情間期，2只仍有規(guī)律動(dòng)情周期變化，動(dòng)情周期為4～5 d，其余4只動(dòng)情期延長(zhǎng)2～3 d，動(dòng)情周期7～8 d。B組從給藥的第5個(gè)周期開始，動(dòng)情周期出現(xiàn)不規(guī)律，主要表現(xiàn)為動(dòng)情后期、動(dòng)情期或動(dòng)情間期的延長(zhǎng)，伴或不伴動(dòng)情周期各階段出現(xiàn)的順序改變，以動(dòng)情后期的延長(zhǎng)為主，2只仍有規(guī)律動(dòng)情周期變化，其余4只動(dòng)情周期延長(zhǎng)至6～8 d；C組從給藥的第3個(gè)周期開始動(dòng)情周期不規(guī)律，主要表現(xiàn)為動(dòng)情間期和動(dòng)情后期的延長(zhǎng)，以及動(dòng)情周期邏輯順序的改變，從第7個(gè)給藥周期開始大鼠全部呈持續(xù)的動(dòng)情間期；D組空白組的大鼠動(dòng)情周期仍規(guī)律地出現(xiàn)，一個(gè)動(dòng)情周期為4～6 d；E組去勢(shì)組呈持續(xù)的動(dòng)情間期。

2.3 各組大鼠血清E2、FSH、AMH水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清E2、FSH、AMH水平比較

注：與D組比較，＊P<0.05；與E組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.4 各組大鼠卵巢病理形態(tài)比較 A組卵巢體積較小，表面顏色淡紅，表面突起的卵泡數(shù)少于D組，始基卵泡數(shù)目少，各級(jí)生長(zhǎng)卵泡較空白組少，成熟卵泡少，顆粒細(xì)胞層次少，卵泡液水平豐富，黃體數(shù)目多，血管數(shù)目少；B組卵巢體積中等，表面顏色鮮紅，表面突起的卵泡數(shù)多，始基卵泡數(shù)目多，各級(jí)生長(zhǎng)卵泡較空白組少，成熟卵泡少，閉鎖卵泡較多，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液水平豐富，黃體數(shù)目少，血管數(shù)目較多；C組卵巢體積大，表面顏色淡紅，各級(jí)卵泡數(shù)量少，閉鎖卵泡數(shù)量多，顆粒細(xì)胞層次不豐，卵泡液水平不豐，黃體數(shù)量不多，血管數(shù)目減少；D組卵巢體積中等，卵巢血供良好，表面顏色鮮紅，表面突起的卵泡數(shù)多，始基卵泡多，各級(jí)卵泡生長(zhǎng)活躍，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液水平多，黃體發(fā)育好，體積大，血管數(shù)目多。

3 討論

大鼠的動(dòng)情周期一般為4～5 d，依次為動(dòng)情前期，動(dòng)情期，動(dòng)情后期和動(dòng)情間期[3]，動(dòng)情前期相當(dāng)于人類的卵泡期，動(dòng)情期相當(dāng)于排卵期，動(dòng)情后期相當(dāng)于黃體早期，動(dòng)情間期相當(dāng)于黃體中晚期和卵泡早期[4]。

本研究中，A組從給藥的第5個(gè)周期開始，動(dòng)情周期開始不規(guī)律，主要表現(xiàn)為動(dòng)情后期的延長(zhǎng)和動(dòng)情周期各階段出現(xiàn)的順序發(fā)生改變，隨著給藥次數(shù)的增多，每個(gè)給藥周期內(nèi)，動(dòng)情期的出現(xiàn)開始延遲，甚至消失，最終從第9個(gè)周期開始呈現(xiàn)出持續(xù)的動(dòng)情間期。B組從給藥的第5個(gè)周期開始，動(dòng)情周期出現(xiàn)不規(guī)律，主要表現(xiàn)為動(dòng)情后期、動(dòng)情期或動(dòng)情間期的延長(zhǎng)，伴或不伴動(dòng)情周期各階段出現(xiàn)的順序改變，以動(dòng)情后期的延長(zhǎng)為主；C組從給藥的第3個(gè)周期開始動(dòng)情周期不規(guī)律，主要表現(xiàn)為動(dòng)情間期和動(dòng)情后期的延長(zhǎng)，以及動(dòng)情周期邏輯順序的改變，從第7個(gè)給藥周期開始大鼠全部呈持續(xù)的動(dòng)情間期。給藥后除了D組的動(dòng)情周期依然呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律外，其余各組動(dòng)情周期均出現(xiàn)了明顯的不規(guī)律。其中以C組動(dòng)情周期的變化與E組最相似，出現(xiàn)了動(dòng)情周期的停滯。CC給藥兩組動(dòng)情周期的改變類似，均以動(dòng)情周期的延長(zhǎng)和動(dòng)情期的延長(zhǎng)為主。有文獻(xiàn)[5]報(bào)道，大鼠在衰老過(guò)程中發(fā)生的第一個(gè)變化即動(dòng)情周期的延長(zhǎng)，通常8個(gè)月以后的大鼠開始出現(xiàn)[6]。同時(shí)，隨著大鼠的衰老，動(dòng)情周期開始出現(xiàn)動(dòng)情期的延長(zhǎng)，陰道涂片呈現(xiàn)持續(xù)的上皮角質(zhì)化，此時(shí)進(jìn)入恒定發(fā)情期[7]。這是排卵障礙的表現(xiàn)，此時(shí)大鼠血清中的E2、睪酮、雄甾酮和孕酮較低且恒定[8]。

CC在給藥后超過(guò)一半的大鼠出現(xiàn)了動(dòng)情周期的延長(zhǎng)和動(dòng)情期的延長(zhǎng)，這點(diǎn)與正常衰老大鼠的動(dòng)情周期變化類似，反應(yīng)了卵巢功能的下降[9]。而PMSG組全部大鼠的動(dòng)情周期發(fā)生改變，以持續(xù)的動(dòng)情間期與動(dòng)情前期的交替為主，出現(xiàn)了動(dòng)情周期的停滯，所以相比于CC組，PMSG組的動(dòng)情周期變化更接近于去勢(shì)組和正常衰老大鼠。

許多研究者[11]認(rèn)為，AMH是預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能和卵巢反應(yīng)性的金標(biāo)準(zhǔn)。AMH是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)家族成員，其作用之一就是抑制原始卵泡激活，減慢卵巢儲(chǔ)備被耗盡的速率。AMH主要表達(dá)于竇前卵泡和竇卵泡[11]，其水平能反映竇卵泡池的大小，代表了剩余原始卵泡的數(shù)量，可以定量反映卵巢儲(chǔ)備。本研究中，各組與E組去勢(shì)組相比較，血清AMH水平間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們分析是因?yàn)锳MH本身數(shù)值較低，測(cè)量誤差較大，且樣本量較小，對(duì)此次的結(jié)果分析造成了一定的干擾。

A、B、C組間血清E2水平與D組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)均明顯高于E組，然而三組大鼠的一般狀態(tài)、動(dòng)情周期變化和卵巢切片均提示卵巢功能有下降。我們分析，可能源于大鼠所處的動(dòng)情周期的不同。因?yàn)槿?shì)組的動(dòng)情周期均處于動(dòng)情間期，而A、B、C組的大鼠動(dòng)情周期發(fā)生了紊亂，但并非完全停滯于動(dòng)情間期，依然有排卵發(fā)生。而在不同的動(dòng)情周期階段E2的變化非常大，排卵前的E2水平必然高于動(dòng)情間期，因?yàn)閯?dòng)情間期相當(dāng)于人類的黃體中后期和卵泡前期。同時(shí)，圍絕經(jīng)期大鼠的雌激素水平相比于青年大鼠，本身就處于正常范圍上下的大幅度波動(dòng)狀態(tài)，直至絕經(jīng)期，雌激素水平才明顯下降，持續(xù)穩(wěn)定在低值。

CC低劑量組和高劑量組的卵巢切片屬“+”，即見生長(zhǎng)卵泡、成熟卵泡及黃體，相比于空白組，成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)較少，顆粒細(xì)胞層次較少，說(shuō)明此時(shí)的大鼠卵巢已經(jīng)出現(xiàn)了排卵障礙，卵巢功能已有下降；PMSG組屬“++”，可見成熟卵泡及黃體，相比于空白組，黃體數(shù)較多，顆粒細(xì)胞層次較少，血管較少，表明此時(shí)C組的卵巢組織各級(jí)生長(zhǎng)卵泡數(shù)目減少，卵巢血供不豐富，其功能已經(jīng)出現(xiàn)了明顯下降。綜合卵巢切片看，C組的卵巢功能相比于A、B組，下降得更明顯，更符合圍絕經(jīng)期卵巢的病理改變[12]。

與D組相比，E組血清E2、AMH水平明顯降低，F(xiàn)SH水平明顯增高且大鼠的動(dòng)情周期持續(xù)處于動(dòng)情間期。但去勢(shì)模型的雌激素水平呈斷崖式下降，與正常圍絕經(jīng)期大鼠雌激素水平的大幅度波動(dòng)不一致，且卵巢切除亦影響了雄激素等其它激素的分泌，這些激素可能在圍絕經(jīng)期中起重要的作用，并對(duì)下丘腦和垂體分泌的激素有反饋?zhàn)饔肹13]，與正常圍絕經(jīng)期的生理變化不一致。而此次采用超促排卵的方法進(jìn)行造模，激素水平的變化和動(dòng)情周期的改變更加貼近于圍絕經(jīng)期的生理變化，體現(xiàn)出了卵巢功能逐漸衰竭的過(guò)程。

綜上所述，5、10 mg/kg的CC灌胃大鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng)，血清E2、AMH水平均降低。超促排卵方法(5、10 mg/kg的CC灌胃)可成功制備圍絕經(jīng)期大鼠模型，所得大鼠卵巢功能降低。