楊鏗，蔣魁，洪敏娜，徐創(chuàng)文，陳海誼，胡曉娟，曹煜成，楊鶯鶯

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300)

酵素菌(BYM)的研究始于20世紀(jì)初期日本柴田欣司氏嘗試用微生物發(fā)酵化肥。后來日本專家島本覺進(jìn)行了深入研究，分離出3類24種有益菌，并按一定比例制成酵素菌原菌。這3類有益菌分別為細(xì)菌(Bacteria，B)、酵母菌(Yeast，Y) 和絲狀菌(Mold，M)，因此，酵素菌簡稱為BYM[1]。目前酵素菌技術(shù)已經(jīng)從水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用擴(kuò)大至凈化水質(zhì)、改良底質(zhì)、抑制病菌、提高水產(chǎn)動物的抗病能力、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和增加經(jīng)濟(jì)效益等領(lǐng)域，是一種很好的調(diào)水劑和飼料添加劑[2-3]。

活性酵素以麩皮為主要原料，可通過多種有益微生物共同作用發(fā)酵制得，富含乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等有益菌及多種酶類和有機(jī)酸。陳景明[4]在飼料中添加不同濃度的活性酵素飼養(yǎng)中華倒刺鲃(SpinibarbusSinensis)的研究發(fā)現(xiàn)，活性酵素能夠很好地促進(jìn)中華倒刺鲃的生長，并對其肝胰臟淀粉酶的最適pH有較大影響。乳酸菌已經(jīng)在人類食品、養(yǎng)殖動物飼料和動保產(chǎn)品中得到廣泛應(yīng)用，具有促進(jìn)消化吸收、改善腸道的作用[5-6]。酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物富含多種酶與營養(yǎng)物質(zhì)，可被養(yǎng)殖動物吸收利用，加快其生長速度[7-9]，常作為營養(yǎng)物質(zhì)添加到飼料中。芽孢桿菌能夠分解養(yǎng)殖池殘餌、死藻和糞便等，并將大分子有機(jī)物殘?jiān)纸鉃樾》肿佑袡C(jī)物，供養(yǎng)殖池藻類利用，調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池氨氮含量和亞硝酸氮含量，保持水質(zhì)穩(wěn)定[10-12]。

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，原產(chǎn)于太平洋沿岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶，1988年由張偉權(quán)教授引入中國，1994年批量育苗成功[13]。現(xiàn)已成為全國沿海主要養(yǎng)殖品種之一，內(nèi)陸地區(qū)也開始大量養(yǎng)殖，2017年產(chǎn)量已達(dá)到108萬t，是推動養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要品種之一。目前關(guān)于凡納濱對蝦的研究主要集中于基因改良[14-17]和病害防治[18-20]，而關(guān)于使用生物發(fā)酵技術(shù)拌料投喂改善養(yǎng)殖環(huán)境和促進(jìn)生長的研究卻少見報道。目前，在凡納濱對蝦的養(yǎng)殖過程中，由水質(zhì)下降而引發(fā)病害爆發(fā)的現(xiàn)象較為常見，已經(jīng)嚴(yán)重影響蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，尋求一種有效改善蝦產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境和促進(jìn)生長的方法非常必要。

本研究將一款由多種復(fù)合菌共同發(fā)酵而成的固體發(fā)酵產(chǎn)品，應(yīng)用于室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖凡納濱對蝦過程，研究其對養(yǎng)殖池水質(zhì)的溶解氧(DO)、pH、氨氮含量、亞硝酸氮含量及對蝦生長等指標(biāo)的影響，旨在探討有效促其生長并可調(diào)節(jié)水質(zhì)的養(yǎng)殖方式，為促進(jìn)凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

主要儀器包括：美國YSI Pro Plus手持式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(美國YSI儀器公司)；AL204 型電子秤(美國丹佛儀器公司)；HACH DR/2400型分光光度計(jì)(美國HACH公司)。

活性酵素：采用固體發(fā)酵技術(shù)，以麩皮為主要原料，通過多種有益微生物共同作用發(fā)酵所得，富含乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等有益菌和蛋白酶、淀粉酶、氨基酸、有機(jī)酸等有益活性物質(zhì)，由廣州市欣海利生生物科技有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)用蝦苗：0.8 cm凡納濱對蝦小蝦苗，800 m2室內(nèi)工廠化水泥池9個，由廣東冠利達(dá)海洋集團(tuán)提供。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)過程在室內(nèi)工廠化水泥池進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)周期為45 d。每個水泥池面積為800 m2，水深1 m，每池的投苗量為30萬尾，共使用9個養(yǎng)殖池(1個對照組和實(shí)驗(yàn)組A、B，每組3個平行實(shí)驗(yàn))。每日投喂餐數(shù)為3餐，時間分別是06：00，11：30，17：00。根據(jù)對蝦生長階段不同，相應(yīng)地改變投料比例，即分別使用不同的飼料(0號料、1號料和2號料)：在養(yǎng)殖前15天, 對照組和實(shí)驗(yàn)組A、B均投喂0號料；在第16～40天, 對照組和實(shí)驗(yàn)組A、B均投喂1號料；在第40～45天, 對照組和實(shí)驗(yàn)組A、B均投喂2號料。自蝦苗入池第2天開始投喂0號蝦苗專用料，每日3餐，按照每餐每10萬尾投喂1 kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，取每餐投料總量1%飼料放在料臺上，用于判斷對蝦吃料情況，其余部分投喂到整池中。若蝦苗在1.5 h內(nèi)把料臺的1%量全部吃完，每餐即增加投料量5%；若未在1.5 h內(nèi)把料臺的1%量吃完，則不增加投喂量。實(shí)驗(yàn)組為在飼料總量不變的情況下飼料拌酵素投喂，比例見表1。

表1 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)Tab.1 Test grouping design

注：0號料酵素和飼料的質(zhì)量比為1∶1，1號料酵素和飼料的質(zhì)量比為1∶4，2號料酵素和飼料的質(zhì)量比為1∶8。

1.3 生長指標(biāo)測定

每15天于每個池塘中隨機(jī)抽取30尾蝦，將蝦置于濾紙上，吸干水分，再用直尺及電子天平稱量其體長、體重。

式(1)

1.4 水質(zhì)指標(biāo)測定

常規(guī)水質(zhì)檢測：每天利用YSI水質(zhì)檢測儀檢測養(yǎng)殖池水溫、DO、pH值等指標(biāo)。

氨氮含量、亞硝酸氮含量檢測：每3天采集對蝦養(yǎng)殖池水樣，在養(yǎng)殖池四角及中間位置設(shè)5個采樣點(diǎn)，采取水面下50 cm水樣，將5個水樣混勻后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，使用HACH速測法(rapid detection method，RDM)進(jìn)行檢測，以HACH分光光度計(jì)為檢測平臺，使用HACH配套試劑包，檢測對蝦養(yǎng)殖池水體氨氮含量和亞硝酸氮含量[21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SD)表示，用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，兩組間使用LSD法比較，P<0.05 表示差異顯著[22]。

2 結(jié)果分析

2.1 對蝦生長情況

活性酵素拌料投喂對凡納濱對蝦生長的影響如圖1所示，對蝦初均重為(0.08±0.01)g，投喂45 d后，對照組終均重為(0.47±0.01)g，而實(shí)驗(yàn)組A、B終均重分別是(0.84±0.02)g和(0.65±0.01)g，2個實(shí)驗(yàn)組的終均重均顯著高于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組A(962.02±13.55)%和實(shí)驗(yàn)組B(726.58±16.04)%的增重率均顯著高于對照組(498.73±17.38)%(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組A和B的體長分別為(5.50±0.14)cm和(4.70±0.15)cm，均顯著高于對照組(4.00±0.20)cm(P<0.05)。添加活性酵素的實(shí)驗(yàn)組A、B在終均重、增重率和終體長均顯著高于對照組(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組A顯著高于實(shí)驗(yàn)組B(P<0.05)?；钚越退乇旧砀缓瑺I養(yǎng)，經(jīng)對蝦攝食后，其所富含的乳酸菌、酵母菌能促進(jìn)對蝦的消化吸收，有利于提高飼料轉(zhuǎn)化率，加快對蝦的生長速度。

圖1 活性酵素對凡納濱對蝦生長的作用(n=3)A:增重率；B：終均重；C：終體長。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。誤差線僅代差異性，標(biāo)準(zhǔn)誤請見具體數(shù)值。Fig.1 Effect of active enzyme on the growth of Litopenaeus vannamei(n=3)A:Weight gain rate；B：Final average weight；C：Final average length. Different lowercase letters indicate statistically significant differences(P<0.05).Error bars only represent differences, standard error of mean are given in specific values.

2.2 養(yǎng)殖池水氨氮、亞硝酸氮含量分析

如圖2所示，對照組水中氨氮含量變化幅度大，在實(shí)驗(yàn)開始的第3天，氨氮含量高達(dá)(2.70±0.03)mg/L，隨后氨氮含量也起伏波動明顯，超出0.5 mg/L的安全濃度水平[23]，說明水質(zhì)不穩(wěn)定。而2個實(shí)驗(yàn)組A、B在整個45 d的實(shí)驗(yàn)周期中，氨氮含量在前3天內(nèi)升高至(2.11±0.03)mg/L，后下降并一直處于低于0.5 mg/L的安全濃度范圍內(nèi)，表明水中氨氮含量相對穩(wěn)定。在對養(yǎng)殖池開始投料后，養(yǎng)殖池中殘餌、糞便等有機(jī)質(zhì)增多，而養(yǎng)殖前期養(yǎng)殖池藻類及有益菌數(shù)量較少，尚不能完全分解利用養(yǎng)殖池殘餌糞便等，且養(yǎng)殖池前期未換水，造成養(yǎng)殖池氨氮含量較高。隨著實(shí)驗(yàn)組活性酵素的使用，有益菌形成優(yōu)勢，開始分解利用養(yǎng)殖池中的大量有機(jī)物，從而穩(wěn)定了養(yǎng)殖池氨氮含量。在12～45 d期間，2個實(shí)驗(yàn)組氨氮含量穩(wěn)定，且顯著低于對照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組A、B間無顯著差異(P>0.05)。

對照組水中亞硝酸氮含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，養(yǎng)殖6 d時，亞硝酸氮含量為(0.12±0.01)mg/L，稍高于安全濃度(0.1 mg/L)；養(yǎng)殖12 d后，亞硝酸氮含量達(dá)到(0.23±0.01)mg/L，隨后下降，但在養(yǎng)殖27 d時，達(dá)到另一個高峰(0.31±0.01)mg/L；整個實(shí)驗(yàn)過程內(nèi)，自第6天起，亞硝酸氮含量持續(xù)高于0.1 mg/L的安全濃度水平[23]。當(dāng)養(yǎng)殖池亞硝酸鹽含量高時，為保證對蝦健康，養(yǎng)殖企業(yè)會采取適當(dāng)?shù)拇胧┙档蛠喯跛岬?，故而出現(xiàn)含量暫時降低的趨勢，但隨著養(yǎng)殖時間的延長，對照組養(yǎng)殖池水中的亞硝酸氮含量總體呈現(xiàn)波浪式上升趨勢。而2個實(shí)驗(yàn)組全程亞硝酸氮含量均無明顯波動，始終低于0.1 mg/L的安全濃度(圖2)。若養(yǎng)殖池中存在大量死藻、殘餌等殘留物，會導(dǎo)致養(yǎng)殖池氨氮含量升高，經(jīng)過養(yǎng)殖池中進(jìn)一步氧化后生成亞硝酸氮，從而影響?zhàn)B殖正常生長，造成養(yǎng)殖動物中毒[24]。本實(shí)驗(yàn)中，投喂含活性酵素的實(shí)驗(yàn)組所在養(yǎng)殖池水中亞硝酸含量始終低于對照組，且維持在低于安全濃度(0.1 mg/L)的范圍內(nèi)，說明活性酵素能夠分解養(yǎng)殖池死藻、殘餌等，有助于調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池亞硝酸含量，穩(wěn)定水質(zhì)。

2.3 養(yǎng)殖池水溫度、溶解氧、pH分析

結(jié)果顯示，3組養(yǎng)殖池DO都處于10～13 mg/L的高濃度水平，溫度范圍為19～23 ℃，pH為7.5～8.4。實(shí)驗(yàn)期間，對照組與實(shí)驗(yàn)組的此3項(xiàng)重要指標(biāo)均處于對蝦最適生長范圍內(nèi)(圖3)，因活性酵素所含乳酸菌、酵母菌，生長代謝不消耗或少消耗養(yǎng)殖池中氧氣，拌料投喂量少，產(chǎn)酸較少，故對養(yǎng)殖池DO、pH無顯著影響。

圖2 活性酵素對養(yǎng)殖池氨氮含量(A)和亞硝酸氮含量(B)的影響(n=3)Fig.2 Effects of active enzyme on ammonia nitrogen(A) and nitrite concentration(B) in the pond(n=3)

3 討論

3.1 適量活性酵素促進(jìn)凡納濱對蝦的生長

在水產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖中，酵素菌已廣泛應(yīng)用在飼料添加劑和拌料投喂中，可有效改善養(yǎng)殖動物腸道環(huán)境、促進(jìn)消化吸收并提高其攝食率[25]。楊濤等[26]開展了利用酵素菌技術(shù)降低養(yǎng)蝦成本、縮短養(yǎng)蝦周期的研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)蝦餌料系數(shù)為0.52時，比一般養(yǎng)蝦餌料系數(shù)降低50%；養(yǎng)殖周期為60 d，達(dá)到比常規(guī)養(yǎng)蝦時間縮短一半的效果，說明酵素菌可有效促進(jìn)對蝦快速生長。本研究中，對照組養(yǎng)殖池水質(zhì)不穩(wěn)定，對蝦生長速度相對較慢；而當(dāng)使用活性酵素拌料投喂凡納濱對蝦時，拌料2餐和拌料3餐的兩個實(shí)驗(yàn)組的終均重、增重率和終體長均顯著高于對照組，促生長作用顯著，且拌料2餐對促進(jìn)凡納濱對蝦生長效果最好。究其原因，可能是在拌3餐酵素時，對蝦攝食到的飼料蛋白過少，不足以滿足對蝦生長需求；而拌料2餐酵素時，對蝦既可攝食到足夠的蛋白，滿足自身生長所需，添加的活性酵素又能夠促進(jìn)對蝦消化吸收，因此對凡納濱對蝦的生長表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用。活性酵素經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測含有大量的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌，乳酸菌含量為9×108cfu/g，酵母菌含量為3.5×106cfu/g，芽孢桿菌含量為4×107cfu/g，粗蛋白含量為 9.55%。這些有益菌被對蝦食用后，可在對蝦腸道內(nèi)形成有益菌優(yōu)勢，抑制有害菌生長，降低發(fā)病率[27]。發(fā)酵后的產(chǎn)物富含蝦青素、蛋白酶、淀粉酶和氨基酸等有益活性物質(zhì)，可促進(jìn)消化吸收，加快對蝦生長速度[2]。

3.2 活性酵素具有調(diào)節(jié)改善養(yǎng)殖池水質(zhì)的作用

工廠化養(yǎng)殖是指采用自動化或半自動化的室內(nèi)高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)，通過一系列的措施控制各項(xiàng)水質(zhì)因子，以達(dá)到保持水質(zhì)穩(wěn)定，提高產(chǎn)量、降低風(fēng)險的目的[28-29]。相比于傳統(tǒng)外塘大水面低密度養(yǎng)殖的時間長、效益低等不足，工廠化養(yǎng)殖模式更科學(xué)、環(huán)保和穩(wěn)定，且經(jīng)濟(jì)效益更好[30]，是一種可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)良養(yǎng)殖模式[31]。但工廠化養(yǎng)殖對蝦，在養(yǎng)殖過程中養(yǎng)殖池中產(chǎn)生的氨氮、亞硝酸氮含量一直是阻礙養(yǎng)殖成功率上升的主要因素。水產(chǎn)養(yǎng)殖對于氨氮含量的要求是低于0.5 mg/L，亞硝酸氮含量低于0.1 mg/L，在此條件下對蝦能健康生長，超過這個含量水平，對蝦即會出現(xiàn)厭食、活力下降及亞硝酸氮中毒等現(xiàn)象，嚴(yán)重時會造成對蝦大量死亡。目前各種除氮措施紛呈，效果存在差異[32]。水體環(huán)境質(zhì)量下降是引起各種病害發(fā)生的主要因素，因此，提高養(yǎng)殖成功率必須從根本上改善養(yǎng)殖池環(huán)境[33-35]。

圖3 活性酵素對養(yǎng)殖池DO(A)、溫度(B)和pH值(C)的影響(n=3)Fig.3 Effects of active enzyme on DO (A), temperature (B) and pH in the pond (C)(n=3)

凡納濱對蝦最適生長的環(huán)境是：pH為7.2～8.8，DO高于4.0 mg/L，氨氮含量低于0.5 mg/L，亞硝酸氮含量低于0.1 mg/L[13]。DO過低、氨氮或亞硝酸氮含量過高都會造成對蝦厭食、中毒，引發(fā)肝胰臟壞死等，嚴(yán)重時會造成對蝦死亡[13]。本研究中，將活性酵素應(yīng)用到養(yǎng)殖池，能夠穩(wěn)定養(yǎng)殖池的pH值于7.5～8.4范圍之間，3組養(yǎng)殖池DO均處于10～13 mg/L的高濃度水平，對DO無明顯影響，這與何沅濱等[36]研究芽孢桿菌在養(yǎng)殖養(yǎng)殖池中對水質(zhì)的影響結(jié)果相似?；钚越退厥嵌喾N有益菌共同發(fā)酵后產(chǎn)物，拌飼料投喂，對養(yǎng)殖池的DO無明顯的影響，能穩(wěn)定養(yǎng)殖池pH，改良水質(zhì)。

氨氮和亞硝酸氮含量是直接影響對蝦健康的重要指標(biāo)，氨氮和亞硝酸氮含量過高，會引起對蝦中毒，吃料慢，甚至死亡的情況[37-38]。在養(yǎng)殖的45 d內(nèi)，對照組氨氮、亞硝酸氮含量不穩(wěn)定，超出安全濃度范圍，分別高達(dá)(2.70±0.03)mg/L和(0.31±0.01)mg/L；而使用活性酵素的A、B實(shí)驗(yàn)組，水中亞硝酸氮含量均未出現(xiàn)過高濃度，一直保持在安全質(zhì)量濃度0.1 mg/L內(nèi)。氨氮含量在最初3 d升高后，隨著活性酵素的使用而迅速降低，保持在安全質(zhì)量濃度范圍0.5 mg/L內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組A和B對養(yǎng)殖池水氨氮、亞硝酸氮含量的影響無明顯差異?；钚越退馗缓樗峋?、酵母菌和芽孢桿菌，對氨氮和亞硝酸氮含量具有顯著的緩解作用，可穩(wěn)定養(yǎng)殖池水質(zhì)[39]?；钚越退匕枇贤段沟金B(yǎng)殖池，部分被對蝦攝食到體內(nèi)，促進(jìn)消化吸收；部分溶解到養(yǎng)殖池中，補(bǔ)充養(yǎng)殖池有益菌，形成有益菌優(yōu)勢，故能改善養(yǎng)殖池水質(zhì)環(huán)境。活性酵素中有益菌及有益活性物質(zhì)在拌料投喂中具體的溶失量，及其對水質(zhì)參數(shù)的影響有待于進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

本研究表明，在養(yǎng)殖密度低于375尾/m3的室內(nèi)養(yǎng)殖養(yǎng)殖池中，每天投喂3餐，早晚拌料2餐活性酵素，可顯著降低水中氨氮、亞硝酸氮含量，能夠調(diào)節(jié)改善水質(zhì)，并能夠顯著增加凡納濱對蝦的體重和體長，對凡納濱對蝦的促生長作用明顯。綜上，活性酵素是一種新型的固體生物發(fā)酵產(chǎn)物，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)安全、健康和高效的水產(chǎn)動保產(chǎn)品。