張濤，周劍光，陳建武，何力

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚(yú)類種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

翹嘴鲌(Culteralburnus)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Cultrinae)、鲌屬(Culter)，在各主要水系的江河、湖泊和水庫(kù)中均有分布，在鲌亞科魚(yú)類中體型相對(duì)較大，在水體中處于中上層，具有體型好、廣溫性、攝食兇猛、生長(zhǎng)快及肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良性狀和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，野生翹嘴鲌一度被過(guò)度捕撈，加之環(huán)境污染，部分地區(qū)翹嘴鲌?zhí)烊毁Y源量下降[1-2]。隨著翹嘴鲌人工繁殖取得成功以及養(yǎng)殖技術(shù)逐漸提高，填充了市場(chǎng)需求，目前在浙江、江蘇、湖北及安徽等地區(qū)已成為主要養(yǎng)殖品種之一。已有研究表明，翹嘴鲌養(yǎng)殖群體遺傳多樣性處于較低水平[3]，為防止翹嘴鲌種質(zhì)資源退化，中國(guó)水產(chǎn)育種工作者開(kāi)展了一系列屬內(nèi)及屬間雜交研究，并取得了一定成果[4-7]。

由于不同種魚(yú)類具有不同的形態(tài)特征，研究外部形態(tài)特征，可通過(guò)形態(tài)測(cè)量獲取可數(shù)性狀和可量性狀數(shù)據(jù)，亦或構(gòu)建判別方程，可以直觀便捷地鑒定魚(yú)的種類[8]。同工酶作為一種生化遺傳參數(shù)，在魚(yú)類的親緣關(guān)系與分類、物種鑒定中的基因表達(dá)與調(diào)控研究以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面得到廣泛的應(yīng)用[9-10]。在生化遺傳標(biāo)記中最常用的是同工酶標(biāo)記，能較好地反映遺傳多樣性，在魚(yú)類種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。趙金良等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，人工雌核發(fā)育團(tuán)頭魴與選育群體在酯酶(EST)上存在的穩(wěn)定差異，可作為該雌核發(fā)育群體與正常發(fā)育群體區(qū)分的生化遺傳標(biāo)志。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)藏北高原色林錯(cuò)裸鯉(Cymnocyprisdistributed in the Selincuo Lake)、納木錯(cuò)裸鯉(Cymnocyprisdistributed in the Namucuo Lake)和措鄂裸鯉(Cymnocyprisdistributed in the Cuoe Lake)的乳酸脫氫酶(LDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和EST 3個(gè)酶譜均表現(xiàn)出種間差異，且同一種群的個(gè)體間也存在明顯的分化。對(duì)同工酶的認(rèn)識(shí)是從LDH開(kāi)始的，LDH也是一種研究相對(duì)深入的同工酶，在魚(yú)類中多由ldh-a、ldh-b和ldh-c基因編碼。ldh-c基因在魚(yú)類中多具有組織特異性，在鯉形目魚(yú)類中其多為肝臟組織所特有，電泳時(shí)多趨向陰極[13]。LDH能使細(xì)胞在供氧不足時(shí)仍能進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，保證肌纖維在缺氧而機(jī)體仍需劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，繼續(xù)完成葡萄糖的無(wú)氧酵解過(guò)程，以提供ATP補(bǔ)充肌肉收縮所需能量[14]。MDH是一種催化蘋(píng)果酸和草酰乙酸相互轉(zhuǎn)變的酶，以細(xì)胞質(zhì)型MDH(s-MDH)和線粒體型MDH(m-MDH)2種類型存在于動(dòng)物組織中，s-MDH主要使細(xì)胞質(zhì)中的草酰乙酸還原成蘋(píng)果酸，再成為丙酮酸進(jìn)入線粒體內(nèi)開(kāi)始新的氧化反應(yīng)，m-MDH可以把蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸從而提供能量[15-16]。

目前有關(guān)翹嘴鲌的報(bào)道主要集中在養(yǎng)殖管理[17-18]、生理學(xué)特性[19-21]、營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性[22-24]、分子生物學(xué)[3,25-26]以及漁業(yè)資源狀況[1-2,27]等方面，關(guān)于翹嘴鲌生化遺傳特性方面也有一些報(bào)道[28-32]，但系統(tǒng)地報(bào)道翹嘴鲌各主要組織同工酶表達(dá)情況的文獻(xiàn)較少。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)描述觀察，測(cè)定可數(shù)、可量性狀，并結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)檢測(cè)不同組織中的LDH和MDH的分布情況，旨在從形態(tài)特征和生化遺傳角度進(jìn)一步豐富翹嘴鲌種質(zhì)資源方面的研究?jī)?nèi)容，同時(shí)篩選出翹嘴鲌種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)，為支撐其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、探討種質(zhì)鑒定在翹嘴鲌資源保護(hù)和良種選育中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用翹嘴鲌于2017年2月采自浙江湖州，共30尾，所有試驗(yàn)魚(yú)均為池塘養(yǎng)殖所得，無(wú)傷、無(wú)畸形，體重為66.2～399.2 g，均值為(156.18±81.38)g，體長(zhǎng)為18.8～33.5 cm，均值為(24.30±3.75)cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)測(cè)定

按照養(yǎng)殖魚(yú)類性狀測(cè)定的國(guó)標(biāo)方法GB/T 18654.3—2008的規(guī)定，用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)對(duì)30尾樣本魚(yú)進(jìn)行測(cè)定?？蓴?shù)性狀包括背鰭和臀鰭的鰭式、脊椎骨數(shù)、側(cè)線鱗數(shù)、側(cè)線上鱗數(shù)、側(cè)線下鱗數(shù)以及左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)，共計(jì)7個(gè)參數(shù)?？闪啃誀畎w長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、尾柄長(zhǎng)和尾柄高，共計(jì)8個(gè)參數(shù)。

1.2.2 組織酶液的制備

組織酶液的制備方法參照張濤等[33-34]進(jìn)行。首先在所測(cè)樣本中選取5尾魚(yú)，進(jìn)行同工酶的普遍篩查，結(jié)合初步篩查結(jié)果確定某種組織的某種同工酶是單態(tài)，再?gòu)乃鶞y(cè)樣本中隨機(jī)抽取10尾健康翹嘴鲌對(duì)該種組織該同工酶進(jìn)行驗(yàn)證，以初步確定翹嘴鲌種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。

于冰水中剪鰓放血后，迅速摘取心臟、眼晶狀體、肌肉和肝臟4種組織，此過(guò)程在冰水浴下完成。各組織經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后，放入低溫冰箱(-80 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品稱重后放入入洗凈預(yù)冷的勻漿器內(nèi)，按質(zhì)量體積比1∶3(g/mL)加入預(yù)冷雙蒸水，冰浴條件下反復(fù)研磨至漿狀，接著在4 ℃、12 000 r/min下離心3次，每次30 min，將上清液分裝，-80 ℃保存以備電泳。

1.2.3 電泳方法

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，凝膠濃度、緩沖液的配制方法及電泳時(shí)間的確定參照孟彥等[35]的方法，并稍作改進(jìn)，主要是將其連續(xù)膠改為不連續(xù)膠。分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為4%，凝膠緩沖液為pH 8.9的Tris-HCl，電極緩沖液為pH 8.3的Tris甘氨酸。電泳采用穩(wěn)壓方式，電壓220 V，電泳時(shí)間為10 h。

1.2.4 染色方法

電泳結(jié)束后將凝膠板取下，室溫避光染色，LDH染色方法參照余來(lái)寧等[36]的方法。待出現(xiàn)清晰條帶后，將凝膠板用去離子水漂洗2～3次。將漂洗后的凝膠板平放在自制燈箱上，用尼康數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.5 模式圖的繪制

采用Bandscan 5.0電泳圖譜中的酶帶進(jìn)行灰度識(shí)別，并根據(jù)識(shí)別灰度繪制電泳圖譜模式圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得可量性狀數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0(IBM公司，美國(guó))進(jìn)行分析，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述及可數(shù)、可量性狀

觀測(cè)60尾翹嘴鲌(圖1)，其體長(zhǎng)而側(cè)扁，腹部在腹鰭基至肛門(mén)間有腹棱，尾柄較長(zhǎng)。頭側(cè)扁，頭背平直。口上位，口裂幾乎與體軸垂直，下頜厚，且向上翹起，突出于上頜之前，為頭的最前端。眼大，位于頭側(cè)上方。鰓孔寬大，向前伸至眼后緣的下方；鰓蓋膜連于峽部。背鰭位于腹鰭基部的后上方，末根不分支鰭條為粗大、光滑的硬刺，背鰭起點(diǎn)距吻端較距尾鰭基為近或相等。臀鰭起點(diǎn)至腹鰭基較至尾鰭基近。胸鰭較短，尖形，末端不達(dá)腹鰭起點(diǎn)。腹鰭位于背鰭前下方，其長(zhǎng)短于胸鰭。尾鰭深叉形，末端尖形。體背部略呈青灰色，體側(cè)呈銀白色，各鰭呈灰黑色。

圖1 翹嘴鲌外觀形態(tài)Fig.1 Morphological measurement of Culter alburnus

鰾分三室，中室最大，后室細(xì)長(zhǎng)而尖；下咽齒3行，齒式為2·4·4/5·4·2或2·4·4/5·3·2或1·4·4/5·4·2；腹膜為銀白色。下咽齒末端成鉤狀。翹嘴鲌可數(shù)、可量性狀分別見(jiàn)表1，表中給出了所測(cè)各指標(biāo)的上下限，均值反映了所測(cè)數(shù)據(jù)的集中程度?？蓴?shù)性狀中側(cè)線鱗數(shù)變動(dòng)范圍最大，背鰭條數(shù)不變。可量性狀中主要以體長(zhǎng)和頭長(zhǎng)為參照，給出了吻長(zhǎng)、眼徑和眼間距等頭部主要參數(shù)與頭長(zhǎng)的比例關(guān)系，也反映了體高、尾柄長(zhǎng)和尾柄高等軀干部主要參數(shù)與體長(zhǎng)的比例關(guān)系(詳見(jiàn)表1中可量性狀的比值)。

表1 翹嘴鲌的可數(shù)性狀和可量性狀的均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 The mean values and standard deviation of countable and measurable parameters of Culter alburnus n=30

2.2 LDH的表達(dá)

翹嘴鲌的LDH同工酶表達(dá)結(jié)果如圖2所示，在翹嘴鲌6種組織中共檢測(cè)到8條LDH酶帶，將靠近陽(yáng)極最近的一條帶定義為L(zhǎng)DH1，自陽(yáng)極向陰極方向依次編號(hào)為L(zhǎng)DH2、3、4、5和6，不同組織中酶帶數(shù)目和活性不同，呈現(xiàn)出明顯的組織特異性。心臟組織中共檢測(cè)到6條LDH酶帶，其中LDH1和LDH2活性較強(qiáng)，LDH6活性最弱，LDH3和LDH4代表同一個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因(圖2A)；眼晶狀體組織中共檢測(cè)到6條LDH酶帶，LDH在翹嘴鲌眼睛中的表達(dá)活性程度較其他5種組織弱，5尾樣本魚(yú)的LDH5和LDH6表達(dá)活性均較強(qiáng)，LDH3和LDH4代表同一個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因(圖2B)；腎臟組織中共檢測(cè)到7條LDH酶帶，3號(hào)魚(yú)LDH1未檢出，其余4尾樣本魚(yú)的酶帶數(shù)和表達(dá)活性相同，LDH2、LDH3、LDH6和LDH7表達(dá)活性均較強(qiáng)，LDH1表達(dá)活性最弱，LDH4和LDH5代表同一個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因(圖2C)；脾臟組織中共檢測(cè)到6條LDH酶帶，5尾樣本魚(yú)LDH酶帶數(shù)相同，LDH1表達(dá)活性最弱，LDH5和LDH6表達(dá)活性均較強(qiáng)，LDH3和LDH4代表同一個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因(圖2D)；肌肉組織中共檢測(cè)到6條LDH酶帶，LDH6表達(dá)活性最強(qiáng)，LDH1和LDH2表達(dá)活性均較弱，LDH3和LDH4代表同一個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因(圖2E)；肝臟中共檢測(cè)到8條LDH酶帶，LDH4、LDH5、LDH7和LDH8表達(dá)活性均較強(qiáng)，LDH1表達(dá)活性最弱，LDH4和LDH5代表同一個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因。LDH8為已獨(dú)立基因編碼區(qū)，為ldh-c基因編碼(圖2F)。

圖2 翹嘴鲌LDH電泳圖譜A、B、C、D、E和F分別表示心臟、眼晶狀體、腎臟、脾臟、肌肉和肝臟的LDH酶譜；1～5泳道分別表示不同個(gè)體的酶譜。Fig.2 Electrophoretogram of LDH isozymes in Culter alburnusA, B, C, D, E, F show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, kidney, spleen, muscle and liver, respectively. 1-5 show the zymograms of different individuals.

2.3 MDH的表達(dá)

翹嘴鲌的MDH同工酶的表達(dá)如圖3所示，在翹嘴鲌6種組織中共檢測(cè)到6條MDH酶帶，將靠近陽(yáng)極最近的一條帶定義為MDH1，自陽(yáng)極向陰極方向依次編號(hào)為MDH2、3、4、5和6，不同組織中酶帶數(shù)目和活性不同，呈現(xiàn)出明顯的組織特異性。心臟組織中共檢測(cè)到6條MDH酶帶，其中MDH3活性較強(qiáng)(圖3A)。眼晶狀體組織中僅檢測(cè)到1條MDH酶帶(圖3B)。腎臟組織中共檢測(cè)到6條MDH酶帶，其中MDH3表達(dá)活性最強(qiáng)，MDH5和MDH6兩條酶帶活性相對(duì)最弱(圖3C)。和腎臟組織類似，脾臟組織中也檢測(cè)到6條MDH酶帶，其中MDH3表達(dá)活性較強(qiáng)，MDH5和MDH6兩條酶帶活性相對(duì)最弱(圖3D)。肌肉組織中共檢測(cè)到4條MDH酶帶，其中MDH2表達(dá)活性較強(qiáng)，其余酶帶表達(dá)活性相對(duì)較弱(圖3E)。肝臟組織中共檢測(cè)到4條MDH酶帶，其中MDH3表達(dá)活性較強(qiáng)，其余酶帶表達(dá)活性相對(duì)較弱(圖3F)。

圖3 翹嘴鲌MDH電泳圖譜A、B、C、D、E和F分別表示心臟、眼晶狀體、腎臟、脾臟、肌肉和肝臟的MDH酶譜；1～5泳道分別表示不同個(gè)體的酶譜。Fig.3 Electrophoretogram of MDH isozymes in Culter alburnusA, B, C, D, E, F show electrophoretograms of MDH isozymes expressed in heart, eye, kidney, spleen, muscle and liver, respectively; 1-5 show the zymograms of different individuals.

2.4 翹嘴鲌?zhí)卣魃z傳參數(shù)

本研究中，5尾樣本魚(yú)腎臟組織LDH酶帶均有多態(tài)現(xiàn)象，表現(xiàn)在不同樣本魚(yú)之間酶帶數(shù)不同，心臟和脾臟中LDH酶帶數(shù)以及各樣本魚(yú)表達(dá)活性程度都相同，但兩者LDH均有拖帶。雖然各樣本魚(yú)眼晶狀體LDH酶帶數(shù)以及表達(dá)活性程度都相同，但對(duì)于個(gè)體小的幼魚(yú)制備同工酶樣品較困難。肝臟成分復(fù)雜，離心后分層多，取上清液時(shí)易吸入表面脂肪層干擾后續(xù)染色過(guò)程。所有樣本魚(yú)肌肉組織LDH酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度相同，而且即使規(guī)格相對(duì)較小的樣本魚(yú)也能取到肌肉組織完成制樣。各組織MDH酶帶較為彌散，其分離效果也不及肌肉LDH，所以初步確定以肌肉組織LDH作為從生化遺傳特征層面鑒定翹嘴鲌種質(zhì)的備選對(duì)象。隨機(jī)選擇10尾樣本魚(yú)的肌肉組織，進(jìn)一步電泳以驗(yàn)證肌肉組織LDH酶帶表達(dá)情況，10尾樣本魚(yú)肌肉組織LDH同工酶圖譜見(jiàn)圖3，全部為單態(tài)，且表達(dá)穩(wěn)定。鑒于此，本研究確定以肌肉組織LDH作為鑒定翹嘴鲌種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。

圖4 翹嘴鲌肌肉組織LDH電泳圖譜1～10泳道分別表示不同個(gè)體的酶譜。Fig.4 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in muscle of Culter alburnus1-10 show the zymograms of different individuals.

3 討論

3.1 翹嘴鲌的形態(tài)學(xué)比較

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)中已報(bào)道翹嘴鲌的形態(tài)特征比較分析，發(fā)現(xiàn)有部分不同的地方。在可數(shù)性狀方面的不同，見(jiàn)表2。造成可數(shù)性狀差異的原因除了與樣本量大小有關(guān)外，還可能與樣本魚(yú)的規(guī)格大小有關(guān)，如本研究中所測(cè)樣本魚(yú)均為成魚(yú)，體長(zhǎng)范圍為27.3～33.5 cm；而《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》[37]和《太湖魚(yú)類志》[38]所測(cè)樣本魚(yú)既有幼魚(yú)，又有性成熟成魚(yú)，體長(zhǎng)范圍分別為5.0～100.0 cm和4.5～27.8 cm。在可量性狀方面，除頭長(zhǎng)/眼間距和體長(zhǎng)/尾柄長(zhǎng)外，其他諸如體長(zhǎng)/體高、體長(zhǎng)/頭長(zhǎng)等參數(shù)的變動(dòng)范圍，本研究所得結(jié)果與《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》[37]和《太湖魚(yú)類志》[38]吻合；但本研究與《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》[37]關(guān)于體長(zhǎng)/尾柄長(zhǎng)的研究結(jié)果分別為5.59～6.78和5.3～6.3；至于頭長(zhǎng)/眼間距，本研究所得結(jié)果與《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》[37]和《太湖魚(yú)類志》[38]分別為4.72～5.50、4.2～5.2和4.5～5.0。造成體長(zhǎng)/尾柄長(zhǎng)以及頭長(zhǎng)/眼間距與本研究間存在差異的原因除了與所測(cè)樣本魚(yú)的規(guī)格和樣本量大小有關(guān)，還可能與測(cè)量方法有關(guān)。如《太湖魚(yú)類志》[38]中標(biāo)本41尾，測(cè)量6尾；本研究測(cè)量樣本60尾。此外，本研究的測(cè)量方法遵照養(yǎng)殖魚(yú)類性狀測(cè)定的國(guó)標(biāo)方法GB/T 18654.3—2008中的眼間距規(guī)定，即眼間距為左右兩眼眶上緣的直線距離，而40多年前《中國(guó)鯉科魚(yú)類志》[37]關(guān)于眼間距的測(cè)量起始點(diǎn)的界定并不清晰，不排除是由參數(shù)測(cè)量起始點(diǎn)不同而導(dǎo)致的結(jié)果差異。

表2 翹嘴鲌可數(shù)性狀的比較Tab.2 Comparations of countable parameters of Culter alburnus

3.2 同工酶表達(dá)的組織特異性

本研究發(fā)現(xiàn)翹嘴鲌的各種組織中均能檢測(cè)到LDH和MDH同工酶的表達(dá)，說(shuō)明翹嘴鲌?bào)w內(nèi)LDH和MDH同工酶分布比較廣泛。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，LDH同工酶在翹嘴鲌組織中的表達(dá)具有組織特異性，即一種同工酶在同一個(gè)體的不同組織器官中表達(dá)的酶帶數(shù)和表達(dá)活性不同。如LDH在翹嘴鲌心臟、腎臟和肝臟中分別檢測(cè)到6、7和8條LDH酶帶。肝臟是以代謝功能為主的器官，具有解毒、儲(chǔ)存糖原、促進(jìn)蛋白合成和分泌膽汁促消化等重要作用。相對(duì)其他幾種組織而言，LDH在肝臟中的表達(dá)酶帶數(shù)較多與肝臟執(zhí)行重要生理功能是相輔相成的。MDH同工酶在翹嘴鲌各組織中的表達(dá)也呈現(xiàn)出組織特異性，MDH在不同組織中表達(dá)的酶帶數(shù)和活性強(qiáng)度不同，心臟、腎臟和脾臟中表達(dá)的酶帶數(shù)比其他3種組織多，腎臟中酶帶的活性強(qiáng)度比眼晶狀體中強(qiáng)。

同工酶在組織器官中的表達(dá)情況受遺傳基因調(diào)控，因此部分酶基因只在特定的組織或器官中表達(dá)。一般認(rèn)為，脊椎動(dòng)物同工酶LDH在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中具有明顯的分化調(diào)控模式，表現(xiàn)出高度的發(fā)育和組織特異性[16]。在脊椎動(dòng)物中，LDH是由A、B和C 3個(gè)基因位點(diǎn)編碼的四聚體蛋白質(zhì)，A、B基因在脊椎動(dòng)物各組織器官中普遍表達(dá)，而C基因的表達(dá)具有高度組織特異性，這種特異性隨物種(特別是類群)不同而有明顯差別[40]。已有研究表明，ldh-c基因在魚(yú)類中多具有組織特異性，鯉形目魚(yú)類中l(wèi)dh-c多為肝臟組織所特有，電泳時(shí)多趨向陰極[13]。本研究中，翹嘴鲌肝臟組織中向陰極遷移的LDH8酶帶，在其他組織中未見(jiàn)表達(dá)，與蔣曉華等[13]在研究滇池高背鯽時(shí)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象類似，初步判定為c帶。

3.3 翹嘴鲌LDH和MDH同工酶的比較及同工酶分析在良種選育中的應(yīng)用

將翹嘴鲌LDH和MDH同工酶的文獻(xiàn)[28-32]與本研究比較，結(jié)果見(jiàn)表3。本研究與已有文獻(xiàn)的研究結(jié)果比較有如下異同點(diǎn)： 1) 除吳興兵等[29]僅以肌肉為研究對(duì)象外，本研究與其余4位研究者都僅在肝臟中發(fā)現(xiàn)了c基因的表達(dá)。2)除楊玲等[31]在黃河翹嘴鲌野生群體心臟中發(fā)現(xiàn)8條LDH酶帶外，本研究中心臟、肌肉和眼睛的LDH酶帶數(shù)均比馬波等[28]、戈志強(qiáng)等[32](沒(méi)研究肌肉和肝臟)、朱華平等[30]及楊玲等[31](心臟除外)的研究結(jié)果多1條帶。分析其原因，本研究認(rèn)為心臟、肌肉和眼睛3種組織的第3和第4條LDH酶帶代表同一位點(diǎn)的2個(gè)等位基因，帶型上可劃為2條酶帶，與之前研究結(jié)果相符[39]；至于楊玲等[31]在黃河翹嘴鲌野生群體中發(fā)現(xiàn)心臟中共有8條LDH酶帶，野生群體心臟LDH酶帶數(shù)比養(yǎng)殖群體多的原因，尚待進(jìn)一步研究。3)除眼睛外，本研究中，心臟、腎臟、肌肉和肝臟MDH酶帶數(shù)與朱華平等[30]的研究結(jié)果一致。關(guān)于本研究與朱華平等[30]眼睛中MDH酶帶數(shù)的差異是否由于不同地理種群造成的，尚有待進(jìn)一步考證。此外，本研究與已報(bào)道的研究結(jié)果之間的差異，還可能與實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)。如本研究肌肉MDH酶帶數(shù)與馬波等[28]的差異，可能是由于兩者分別采用淀粉凝膠水平電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳所致；不同凝膠濃度也可能會(huì)造成差異，因不同濃度的凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)空隙大小不同，使得電泳過(guò)程中對(duì)酶帶的分離效果不同。

同工酶種類較多，除了本研究中涉及的LDH和MDH，常見(jiàn)的還有酯酶(EST)、醇脫氫酶(ADH)和超氧化物歧化酶(SOD)等，其中LDH是研究最早也是研究最深入的同工酶之一，LDH和MDH在機(jī)體生理功能中扮演重要的角色，不少魚(yú)類種質(zhì)生化遺傳特性研究中均以LDH或MDH作為重要的參考指標(biāo)[39,43-45]，不同組織的LDH或MDH表現(xiàn)出明顯的差異性。鑒于此，本研究選擇LDH和MDH作為研究翹嘴鲌生化遺傳特性的參考指標(biāo)，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，肌肉組織LDH酶帶數(shù)和表達(dá)活性穩(wěn)定且相同，確定為鑒定翹嘴鲌種質(zhì)的特征遺傳參數(shù)。

表3 翹嘴鲌LDH和MDH研究結(jié)果比較Tab.3 Comparations of research results about LDH and MDH isozymes expressed in Culter alburnus

注：“—”表示無(wú)。

另由于天然水域中鲌屬魚(yú)類種間能進(jìn)行雜交產(chǎn)生可育后代[46]，通過(guò)對(duì)翹嘴鲌同工酶的研究能有效鑒定出雜交后代并與父母本的親緣關(guān)系作比較，也為翹嘴鲌的良種選育提供理論依據(jù)，這一技術(shù)已應(yīng)用在不少魚(yú)類良種選育過(guò)程中[47-49]。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法觀測(cè)了翹嘴鲌的形態(tài)特征，其側(cè)線鱗、臀鰭條和鰓耙數(shù)目分別為75～89、20～24和23～26，部分可數(shù)、可量性狀與已報(bào)道文獻(xiàn)[37-38]存在差異,可能是由于樣本數(shù)量、規(guī)格以及測(cè)量方法不同所致。同時(shí)，通過(guò)PAGE電泳較為系統(tǒng)地對(duì)翹嘴鲌6種主要組織的LDH和MDH同工酶進(jìn)行分析，初步確定了肌肉組織中LDH表達(dá)量高且活性穩(wěn)定，可作為鑒定翹嘴鲌種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。對(duì)翹嘴鲌同工酶的分析，有利于從生化遺傳層面比較翹嘴鲌與其他鲌屬魚(yú)類的親緣關(guān)系，同時(shí)可為其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立及良種選育提供參考依據(jù)。