張華威，崔艷梅，王倩，韓典峰，羅晶晶，黃會，李佳蔚，宮向紅*

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006；

2. 淄博德安環(huán)境檢測有限公司，山東 淄博 255000)

擬除蟲菊酯類殺蟲劑是一類高效、低毒的廣譜殺蟲劑[1]，目前全世界已有幾十種擬除蟲菊酯類殺蟲劑成功被商業(yè)化[2]，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等過程中被廣泛運用并發(fā)揮了重要作用[3]。隨著近年來部分高毒農(nóng)藥逐漸被禁用[4]，擬除蟲菊酯類殺蟲劑因廣譜、低毒和高效等優(yōu)良特性在中國得到迅速推廣，尤其已在農(nóng)業(yè)及林業(yè)領(lǐng)域大范圍使用，且使用量不斷增加[4]。擬除蟲菊酯類殺蟲劑可隨雨水及生活廢水等途徑進(jìn)入水環(huán)境[5]，造成水體污染。此外，由于擬除蟲菊酯類殺蟲劑具有親脂性，對水生生物具有較高的毒性且容易在水生生物中富集，通過食物鏈的傳遞，進(jìn)而對近海的魚蝦貝蟹類等水產(chǎn)品造成危害[6]，破壞生態(tài)系統(tǒng)[7]，甚至對人類健康造成嚴(yán)重威脅。因此，對海水中擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留量進(jìn)行監(jiān)測十分必要。

目前，常用的檢測擬除蟲菊酯類殺蟲劑的方法主要有氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]、液相色譜法[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]、分光光度法(UV-VIS)[16]、薄層色譜法(TLC)[17]和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[18]等，每種方法均有其優(yōu)勢和不足。分光光度法、薄層色譜法及酶聯(lián)免疫法雖然檢測步驟相對簡單快速，但其可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且無法準(zhǔn)確定量，陽性樣品必須需用其他方法再做進(jìn)一步的確證。氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法可對菊酯類殺蟲劑進(jìn)行準(zhǔn)確定量，其中氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在定性方面相比于氣相色譜法更加準(zhǔn)確且抗基質(zhì)干擾能力更強，但是由于大部分常用菊酯農(nóng)藥中均含有鹵素原子等使其具有電負(fù)性的物質(zhì)，因此使用氣相色譜儀的ECD檢測器檢測可獲得更低的檢測限，且氣相色譜法相對于質(zhì)譜法定量更加準(zhǔn)確，重現(xiàn)性更好。液相色譜法的定量限相比于氣相色譜法更高，即在測定低濃度樣品時存在劣勢。因此，氣相色譜法在實際檢測海水中13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑時更具優(yōu)勢。

已有研究中，擬除蟲菊酯類殺蟲劑的檢測方法大多針對于果蔬[19-21]、茶葉[22-24]、水產(chǎn)品[25-27]和沉積物[28-29]等，而對海水中的擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留量檢測的報道較少。在海水中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的測定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方面，HJ 698—2014《水質(zhì) 百菌清和溴氰菊酯的測定 氣相色譜法》[30]規(guī)定了水中溴氰菊酯的氣相色譜測定方法；HJ 753—2015《水質(zhì) 百菌清及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[31]規(guī)定了水中8種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的測定方法；SL 740—2016《水質(zhì) 甲萘威、溴氰菊酯、微囊藻毒素-LR的測定 高效液相色譜法》[32]規(guī)定了測定水中溴氰菊酯的高效液相色譜法。這些方法多是針對水體中2～8種擬除蟲菊酯類藥物的同時檢測，而實際海水中通常存在更為廣泛的擬除蟲菊酯類藥物。為更準(zhǔn)確地檢測海水中擬除蟲菊酯類藥物殘留量，更加客觀地反映某一區(qū)域水體中該類藥物的總體殘留狀況，本研究采用二氯甲烷作為提取溶劑，經(jīng)Florisil固相萃取柱凈化和氣相色譜法檢測，建立了海水中13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的快速、靈敏且準(zhǔn)確的檢測方法，以滿足海水中農(nóng)藥殘留分析的要求，為海水質(zhì)量監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：配有電子捕獲檢測器(ECD)的Agilent 7890A氣相色譜儀購自美國Agilent公司；高速控溫離心機購自美國Sigma公司；N-EVAPTM112氮吹儀購自美國Qrganomation Associates公司；Milli-Q Gradient超純水儀購自法國Millipore公司；KQ-600E超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自德國IKA公司；分液漏斗振蕩器購自上海愛朗儀器有限公司；玻璃砂芯抽濾裝置購自四川蜀牛公司；0.45 μm混合纖維素濾膜購自上海興亞凈化材料廠；分液漏斗(1 L)購自四川蜀牛公司；玻璃砂芯層析柱(24 mm×400 mm)購自四川蜀牛公司；NH2固相萃取柱(3 mL/500 mg)購自CNW公司；HLB固相萃取柱(3 cc/60 mg)購自美國Waters公司；Florisil固相萃取柱(6 mL/1 g)、DB-5毛細(xì)管色譜柱、HP-5毛細(xì)管色譜柱和DB-17毛細(xì)管色譜柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)購自美國Agilent公司。

主要試劑：正己烷、二氯甲烷、環(huán)己烷和乙酸乙酯(色譜純，德國Merck公司)；丙酮(分析純，國藥集團(tuán))。13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑(七氟菊酯、丙烯菊酯、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氟丙菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯和溴氰菊酯)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥98%，德國Dr. Ehrenstorfer公司)；實驗用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取適量擬除蟲菊酯類殺蟲劑標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解，配置成1 000.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，使用前用正己烷稀釋至所需質(zhì)量濃度，4 ℃保存，有效期為6個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確移取13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各0.5 mL，于50 mL容量瓶中，用正己烷稀釋并定容至刻度，配制成13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑均為10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，有效期為2周。使用前用正己烷稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2 樣品提取與凈化

1.2.1 樣品處理

將待測海水樣品用玻璃砂芯抽濾裝置經(jīng)0.45 μm混合纖維素濾膜過濾。

1.2.2 提取方法

準(zhǔn)確量取500 mL過濾后的海水樣品置于1 L分液漏斗中，加入30 mL二氯甲烷，振蕩10 s并排氣，置于分液漏斗振蕩器上振蕩300 s，靜置分層，將下層有機相收集于150 mL三角瓶中，于上層水相加入30 mL二氯甲烷，按照同上步驟重復(fù)提取一次，合并下層有機相，待用。

1.2.3 凈化方法

將上述提取液轉(zhuǎn)移到填充無水硫酸鈉的砂芯層析柱(無水硫酸鈉柱為8 cm，干法填充)中，使其緩慢通過無水硫酸鈉柱，收集于100 mL雞心瓶中，再用10 mL二氯甲烷淋洗2次，合并淋洗液于100 mL雞心瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35 ℃濃縮至近干，用5 mL正己烷溶解殘渣，待用。

取Florisil固相萃取小柱，依次用5 mL正己烷-丙酮-乙酸乙酯混合溶液(85∶5∶10,V/V)和5 mL正己烷活化，加入上述復(fù)溶液，5 mL正己烷淋洗，棄去全部流出液，用10 mL正己烷-丙酮-乙酸乙酯混合溶液(85∶5∶10,V/V)洗脫。洗脫液于40 ℃氮氣吹至近干，用正己烷定容至1 mL，待氣相色譜(GC)分析。

1.3 色譜條件

色譜柱選用DB-5(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)或性能相當(dāng)者；載氣為高純氮氣；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；檢測器溫度310 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

升溫程序：70 ℃保持1 min，以30 ℃/min升至210 ℃，以2 ℃/min升至233 ℃，以1 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。

1.4 殘留量的計算

按式(1)計算試樣中13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留量。

(1)

式中：X為海水中被測組分的殘留量(ng/L)；Ci為海水樣品經(jīng)提取凈化濃縮后的待上機溶液中被測組分的測定濃度(ng/mL)；V1為海水樣品經(jīng)提取凈化濃縮后的待上機溶液的體積(mL)；V為待測海水的體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的確定

大部分?jǐn)M除蟲菊酯類殺蟲劑具有電負(fù)性，因此，其在帶有電子捕獲檢測器(ECD)的氣相色譜儀上具有更好的選擇性和更高的響應(yīng)值。通過對DB-5(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)、HP-5(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)和DB-17(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)DB-5毛細(xì)管色譜柱對13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的分離效果更好，因此本研究選用DB-5(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)作為檢測色譜柱。

2.1.2 程序升溫的確定

由于本方法所檢測的物質(zhì)種類達(dá)13種，且其中7種物質(zhì)具有同分異構(gòu)體，因此，需要對程序升溫過程進(jìn)行優(yōu)化，避免出峰時間重合。實驗結(jié)果表明，七氟菊酯、丙烯菊酯、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯和氟丙菊酯在DB-5毛細(xì)管色譜柱的出峰時間靠前；氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯和溴氰菊酯等均具有同分異構(gòu)體，出峰時間靠后。因此，升溫程序設(shè)定時前期快速升溫，以快速排出大部分雜質(zhì)，避免雜峰影響待測物質(zhì)；中期緩慢升溫，使聯(lián)苯菊酯與甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯與氟丙菊酯完全分離；后期緩慢升溫，使各同分異構(gòu)體分離?？紤]到分析時間過久容易降低總體檢測效率，最終本研究確定升溫程序：70 ℃保持1 min；30 ℃/min升至210 ℃；2 ℃/min升至233 ℃；1 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。

2.1.3 其他色譜條件的確定

載氣流速可以較為明顯地影響待測物質(zhì)的出峰時間，較低的載氣流速可使各待測物更易分離，然而過低的流速會延長各待測物的出峰時間，增加程序升溫的時間將降低檢測的效率；而較高的載氣流速可以使待測物質(zhì)的出峰時間提前，減少分析時間，提升檢測效率。本研究中，檢測物質(zhì)種類較多，且半數(shù)具有同分異構(gòu)體，較高的載氣流速容易造成多數(shù)同分異構(gòu)體的峰無法分離，影響檢測準(zhǔn)確性，因此，需要綜合考慮載氣流速與程序升溫，最終本研究確定載氣流速為1.0 mL/min。

一般情況下，進(jìn)樣口汽化室的溫度最好高于待測組分的沸點，以保證待測組分均能汽化進(jìn)入色譜柱；檢測器溫度應(yīng)高于進(jìn)樣口及柱溫箱的最高溫度，保證通過色譜柱進(jìn)入檢測器的待測組分及雜質(zhì)均能被去除，保護(hù)檢測器不被污染。因此，本研究將進(jìn)樣口溫度設(shè)置為230 ℃，檢測器溫度設(shè)置為310 ℃。

13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(50.0 μg/L)的氣相色譜圖見圖1。

圖1 13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(50.0 μg·L-1)色譜圖Fig.1 Chromatograms of 13 kinds of pyrethroid insecticides (50.0 μg·L-1)

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取條件的確定

以空白海水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，分別以二氯甲烷、正己烷和環(huán)己烷等3種有機溶劑為提取液，比較了不同提取溶劑對13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑提取效率的影響(圖2)?？梢钥闯?，二氯甲烷對13種待測物的提取效率均大于70%，優(yōu)于正己烷和環(huán)己烷提取效果，因此選用二氯甲烷作為提取溶劑。

2.2.2 提取次數(shù)的確定

以二氯甲烷作為提取溶劑，分別用30 mL提取溶劑提取1次、30 mL提取溶劑提取2次、30 mL提取溶劑提取3次進(jìn)行實驗(圖3)。結(jié)果表明，提取2次后，再增加提取次數(shù)回收率并沒有明顯增加。為提高檢測工作效率，實驗采用2次提取。

圖2 3種提取溶劑對13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑平均回收率的影響(n=3)TF:七氟菊酯; AT:丙烯菊酯; BF:聯(lián)苯菊酯; FP:甲氰菊酯; CH:三氟氯氰菊酯; AR:氟丙菊酯; PM:氯菊酯; CF:氟氯氰菊酯; CM:氯氰菊酯; FC:氟氰戊菊酯; FV:氰戊菊酯; TFL:氟胺氰菊酯; DM:溴氰菊酯。下同。Fig.2 Effect of 3 kinds of extraction solvents on mean recoveries of 13 kinds of pyrethroid insecticides (n=3)TF: tefluthrin; AT: allethrin; BF: bifenthrin; FP: fenpropathrin; CH: cyhalothrin; AR: acrinathrin; PM: permethrin; CF: cyfluthrin; CM: cypermethrin; FC: flucythrinate; FV: fenvalerate; TFL: Tau-fluvalinate; DM: deltamethrin. The same below.

圖3 不同提取次數(shù)對13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑平均回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different extraction times on mean recoveries of 13 kinds of pyrethroid insecticides(n=3)

2.2.3 凈化方法的選擇及優(yōu)化

由于提取溶劑二氯甲烷呈中等極性，其在提取過程中會提取出大量雜質(zhì)，可能污染色譜分析系統(tǒng)并對結(jié)果造成影響，因此需對提取液進(jìn)行充分凈化。本研究考察了Florisil固相萃取柱、NH2固相萃取柱和HLB固相萃取柱對提取液的凈化效果(圖4)，結(jié)果表明，使用Florisil固相萃取柱凈化樣品時，13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的回收率均大于70%，且凈化效果良好，優(yōu)于NH2固相萃取柱及HLB固相萃取柱。因此，本研究選擇Florisil固相萃取柱作為凈化柱。

圖4 3種固相萃取柱對13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑平均回收率的影響(n=3)Fig.4 Effects of 3 kinds of SPE on mean recoveries of 13 kinds of pyrethroid insecticides (n=3)

根據(jù)擬除蟲菊酯類殺蟲劑呈弱極性的特征，分別選用正己烷-丙酮混合溶液(95∶5,V/V)、正己烷-乙酸乙酯混合溶液(90∶10,V/V)及正己烷-丙酮-乙酸乙酯混合溶液(85∶5∶10,V/V)作為Florisil固相萃取柱的洗脫溶劑進(jìn)行試驗。實驗表明，使用正己烷-丙酮-乙酸乙酯混合溶液(85∶5∶10,V/V)作為洗脫溶劑時，洗脫效果最好，其回收率明顯高于其他2種洗脫劑，同時實驗發(fā)現(xiàn)10 mL正己烷-丙酮-乙酸乙酯混合溶液(85∶5∶10,V/V)即可使13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的回收率均達(dá)到70%以上。因此，本研究選擇正己烷-丙酮-乙酸乙酯混合溶液(85∶5∶10,V/V)作為Florisil固相萃取柱的洗脫溶劑。

2.3 線性范圍和靈敏度

取適量擬除蟲菊酯類殺蟲劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成2.5、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3條件下依次測定，以各組分響應(yīng)值為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑在2.5～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好。采用加標(biāo)回收法確定各組分的檢出限(LOD)及定量限(LOQ)，以信噪比S/N≥3確定各組分LOD，以信噪比S/N≥10來確定各組分LOQ。本方法對13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的檢出限均為5.0 ng/L，定量限均為10.0 ng/L(表1)。本研究所建立的方法靈敏度較高，檢出限與定量限較HJ 698—2014、HJ753—2015及SL 740—2016等標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)的待測組分更低，在海水監(jiān)測中能夠提供更加準(zhǔn)確的結(jié)果，適用于海水中擬除蟲菊酯類殺蟲劑的定量分析。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

選取空白海水樣品為測試基質(zhì)，分別添加一定量擬除蟲菊酯類殺蟲劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其質(zhì)量濃度分別為10.0、50.0和100.0 ng/L，按本研究的方法進(jìn)行測定，每個水平做6個平行樣品，并計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑在海水中的加標(biāo)回收率為76.6 %～107.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%～12.7%。海水空白樣品與加標(biāo)回收樣品(10.0 ng/L)氣相色譜圖分別示于圖5和圖6，由圖可見，實驗條件下，待測組分能與雜質(zhì)有效分離，滿足海水中13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的分析要求。

表1 13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear equations, linearity range and correlation coefficient of 13 kinds of pyrethroid insecticides

圖5 空白海水樣品色譜圖Fig.5 Chromatograms of blank samples in seawater

圖6 海水中13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑加標(biāo)樣品(10.0 ng·L-1)色譜圖Fig.6 Chromatograms of spiked samples with 13 kinds of pyrethroid insecticides in seawater (10.0 ng·L-1)

2.5 實際樣品測定

使用本方法對山東省某沿海地區(qū)采集的海水樣品進(jìn)行測定，其中部分樣品檢出甲氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯及溴氰菊酯等(圖7)殘留，選取其中3個樣品，實際測定結(jié)果見表3。

圖7 海水樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of seawater samples

3 結(jié)論

本研究建立了可同時檢測海水中13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留量的方法。方法采用二氯甲烷作為提取溶劑，F(xiàn)lorisil固相萃取柱凈化，外標(biāo)法定量，13種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的檢出限均為5.0 ng/L，定量限均為10.0 ng/L。本方法與目前常用方法相較，可同時檢測更多擬除蟲菊酯類殺蟲劑種類(13種)，且被測組分的定量限更低，在對未知樣品的實際分析中有望得到更全面的分析結(jié)果。

表3 海水樣品中擬除蟲菊酯類殺蟲劑測定結(jié)果Tab.3 Contents of pyrethroid insecticides in seawater ng·L-1