李懷東，張兆瑞，陳良安

原發(fā)肺沖擊傷（primary blast lung injury，BLI）是指爆炸時(shí)產(chǎn)生沖擊波超壓直接作用于胸部造成的肺損傷［1，2］。 BLI是導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的重要病因，病死率高［3］。 近年來，全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）作為呼吸攜氧介質(zhì)治療ARDS引發(fā)了液體通氣研究的熱潮。PFC以其攜氧能力強(qiáng)、溶解和釋放氧快（10毫秒內(nèi)）等特點(diǎn)［4］，已經(jīng)用于液體通氣中霧化或汽化吸入治療ARDS的實(shí)驗(yàn)研究，可能通過抑制中性粒細(xì)胞的活化和減少中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的遷移和募集［5］、抑制巨噬細(xì)胞釋放炎性分子［6］、抑制NF-κB的活化和抑制MAPK通路［7］等機(jī)制，從而提高動脈血氧分壓，改善氧合、提高肺臟順應(yīng)性，減輕肺組織的炎癥反應(yīng)，有助于改善ARDS的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸［7］。

microRNA（miRNA）是在真核生物中存在的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小RNA分子（長度約22個(gè)核苷酸），在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［8］。miRNA通過與靶mRNA特異結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用。miRNA在ARDS敏感性上起著潛在的關(guān)鍵作用，且在多種炎癥性肺病中發(fā)揮著影響［9］。miRNA芯片技術(shù)是高通量研究miRNA的有效的手段，已經(jīng)在腫瘤、心血管疾病等學(xué)科開展了分子機(jī)制的相關(guān)研究。該研究通過miRNA芯片篩選PFC作用BLI犬相關(guān)的miRNA及其靶基因，探討汽化吸入PFC能否通過miRNA的表達(dá)來調(diào)控BLI相關(guān)基因的變化，為深入研究PFC的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料及儀器 小型沖擊波發(fā)生器（北京理工大學(xué)爆炸科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；PB7200呼吸機(jī)（美國Puritan-Bennett公司）；全氟辛烷（上海華捷視醫(yī)療設(shè)備有限公司）；FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit（批號：20131127）；GeneChip○ R Hybridization （批號：20131216）；AMBION 動物試劑盒 （批號：20130523）；掃描儀、雜交爐、洗滌工作站、2100振蕩器、NanoDrop、PCR儀 （美國Affymetrix公司）；離心機(jī)、濃縮儀（德國eppendorf公司）；金屬浴-2、金屬浴-3（杭州博日科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會（解放軍總醫(yī)院福利倫理審查批號：2012-D6-06）審核通過，該實(shí)驗(yàn)采用8～15月齡健康雜種犬18只（購自北京綠源偉業(yè)養(yǎng)殖場），雌雄不限，體重9.0～12.0 kg，平均（10.84±1.60）kg，由解放軍總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心（實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0062）室溫飼養(yǎng)3 d。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，每組9只。

1.2方 法

1.2.1 分組 犬稱重后選取四肢淺靜脈注射3%戊巴比妥鈉（25～30 mg/kg）麻醉后綁縛四肢取仰臥位于手術(shù)臺上固定。采用北京理工大學(xué)爆炸科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的小型沖擊波發(fā)生器，按照實(shí)驗(yàn)流程制備肺沖擊傷犬模型［10］。分為兩組：單純肺沖擊傷組（BLI組，縮寫為B組，n=9）：制作原發(fā)肺沖擊傷模型成功后，觀察7 h。肺沖擊傷PFC汽化吸入通氣組（BLI+MV+PFC 組，縮寫為 BMP 組，n=9）：制作原發(fā)肺沖擊傷模型成功后，在常規(guī)機(jī)械通氣基礎(chǔ)上（容量控制，呼吸頻率（f）為 16 次/min；潮氣量（Vt）為 10 ml/kg；吸呼比（I∶E）為 1∶1.5；吸入氧濃度（FiO2）為0.6；外源性呼氣末正壓（PEEP）為5 cmH2O；恒定流速波送氣。調(diào)整好后至機(jī)械通氣結(jié)束不改變呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)定），經(jīng)呼吸機(jī)吸氣管路應(yīng)用濕化罐裝置加熱（調(diào)整濕化器溫度至48～50℃加熱PFC）蒸發(fā)給予 PFC（10 ml/kg·h）連續(xù)汽化吸入治療 2 h，然后繼續(xù)常規(guī)機(jī)械通氣5 h。實(shí)驗(yàn)犬處死后立即開胸解剖取出致傷肺葉眼科剪剪取約2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm肺組織多塊分裝入凍存管中立即置入液氮罐中速凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣本處理 總RNA的提?。阂旱拗腥〕鰞龃娴膶?shí)驗(yàn)犬肺組織，眼科剪剪取10 mg肺組織，移入加入適量液氮的研缽中，快速用力研磨成勻漿，移入勻漿器中加入10倍體積的lysis/binding buffer（1 ml lysis/binding buffer/0.1 g 組織）徹底混勻。加入1/10體積的Homogenate additive，渦旋振蕩器充分混勻，冰上放置10 min（以上操作在冰上）。加入與 lysis（不計(jì) Homogenate additive）相同體積 的 acid-phenol：chloroform （300 μl lysis/300 μl acid-phenol：chloroform），渦旋混勻 30～60 s，室溫10 000 g離心5 min。取上清置入一新管中，記錄體積。加入1.25倍體積無水乙醇，渦旋振蕩器充分混勻，反復(fù)過純化柱，體積不超過 700 μl，10 000 g 離心 15 s。加入 350 μl wash 1，離心 5～10 s，清洗純化柱，10 000 g 離心 15 s，棄過濾液。 DNase I 10 μl和Buffer RDD 70 μl加入膜上（QIAGEN#79254），20～30℃放置 15min。加入 350μl wash 1，離心 5～10s，清洗純化柱，10000g離心15s，棄過濾液。加入500μl wash 2/3，離心 5～10 s，清洗純化柱兩次，10 000 g 離心15 s，棄過濾液，離心1 min。將離心柱放置到新的收集管中，柱中心加入 100 μl 95℃預(yù)熱的Elution Solution或nuclease-free水，室溫最高轉(zhuǎn)速離心 20～30 s，收集管中液體即為提取的 Total RNA，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)或放置在-70℃冰箱中保存。樣品總RNA利用NanoDrop ND-2100 （Thermo Scientific）定量，并應(yīng)用Agilent 2100檢測RNA的完整性。總RNA加尾、生物素標(biāo)記、芯片雜交及洗脫、洗滌、染色和掃描等步驟，按照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

1.2.3 圖像采集與數(shù)據(jù)分析 采用Affymetrix Gene Chip Command Console 軟件（version4.0，Affymetrix）處理原始圖像，用Expression Console（version1.3.1，Affymetrix）讀取原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行RMA標(biāo)準(zhǔn)化。再利用 Genespring軟件 （version 12.5；Agilent Technologies）進(jìn)行后續(xù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行探針過濾，用于比較的每組樣本中，至少有一組100%標(biāo)記為“P”的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。利用Fold Change檢驗(yàn)的倍數(shù)變化值進(jìn)行篩選差異miRNA，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0。

2 結(jié)果

2.1 樣本質(zhì)檢報(bào)告取B組不同犬肺組織樣品5個(gè) （每個(gè)0.1 g）和BMP組不同犬肺組織樣品5個(gè)（每個(gè)0.1 g），送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司檢測樣本，結(jié)果見表1。

2.2 兩組樣本miRNA芯片標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)將B組和BMP組犬肺組織經(jīng)miRNA芯片處理后的單熒光芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，兩組數(shù)據(jù)總體分布具有對稱性，分布集中。項(xiàng)目總體評價(jià)為成功。見圖1。

表1 RNA（包含miRNA）Agilent 2100法質(zhì)檢結(jié)果

圖1 BMP-G vs.B-G信號雜交散點(diǎn)圖

2.3 篩選差異表達(dá)的miRNA應(yīng)用Affymetrix miRNA 4.0芯片篩選，共有20條miRNA表達(dá)上調(diào)，3條miRNA表達(dá)下調(diào) （表2，表3）。推測這些miRNA可能與PFC的作用存在關(guān)聯(lián)。

表2 差異miRNA的統(tǒng)計(jì)

表3 Affymetrix miRNA 4.0芯片篩選得到的差異miRNA列表

2.4miRNA芯片數(shù)據(jù)的基因功能富集分析miRNA序列數(shù)據(jù)為miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫，mRNA序列為犬的mRNA 3'UTR序列數(shù)據(jù)。對差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，靶基因共449個(gè)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO條目中所包括的靶基因個(gè)數(shù)，并用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)GO條目中靶基因功能富集的顯著性。GO功能富集分析這些靶基因主要涉及分子功能（molecular function）、細(xì)胞組成（cellular component）、生物過程（biological process）等功能。 見圖 2。

應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行pathway分析，并且用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)pathway條目中靶基因功能富集的顯著性。Pathway功能富集分析這些靶基因主要與癌癥信號通路、細(xì)胞焦點(diǎn)粘連通路、細(xì)胞因子受體間相互作用通路等有關(guān)。見圖3。

3 討論

miRNA通過與靶mRNA特異結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［11］，在多種生理病理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與免疫反應(yīng)［12］和炎癥通路［13］有關(guān)，也與炎癥性肺病密切相關(guān)［14］，尤其在動物模型實(shí)驗(yàn)上，miRNA表達(dá)改變與ARDS的病理生理進(jìn)程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)聯(lián)，miRNA在ARDS敏感性上起著潛在的關(guān)鍵作用，已成為 ARDS新的治療靶點(diǎn)［15］。研究表明，miR-150［13］、miR-16［16］、miR-127［17］、miR-494［18］參 與 了ARDS炎癥過程。由miRNA引起的相關(guān)基因表達(dá)變化可能會影響到大量的后續(xù)基因的表達(dá)，繼而對機(jī)體多種生物學(xué)過程產(chǎn)生影響。對ARDS相關(guān)miRNA靶基因進(jìn)行調(diào)控干預(yù)可能是防治ARDS的新策略。

有研究［18］發(fā)現(xiàn)抑制miR-494表達(dá)可作為膿血癥相關(guān)ARDS大鼠模型的治療選擇。

圖2 差異miRNA的GO富集分析

圖3 差異miRNA的KEGG pathway富集分析

miRNA芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于人類和動物生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究中，如鑒定生長、分化、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及鑒定疾病相關(guān)基因等。該研究采用Affymetrix基因芯片技術(shù)篩選PFC作用BLI犬相關(guān)的miRNA。結(jié)果篩選到23條差異表達(dá)的miRNA及預(yù)測的靶基因449個(gè)，在基因Gene Ontology數(shù)據(jù)庫和KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異miRNA的GO富集分析和pathway富集分析，涉及相關(guān)的功能和通路，可能是PFC作用BLI犬相關(guān)的miRNA及其靶基因。通過差異基因的GO富集分析，可以尋找PFC作用BLI犬肺組織相關(guān)的靶基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)。GO富集分析預(yù)測靶基因共449個(gè)，主要涉及分子功能、細(xì)胞組成、生物過程等功能。Pathway富集分析可以尋找PFC作用BLI犬肺組織的差異基因可能和哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。Pathway富集分析這些靶基因主要與癌癥信號通路、細(xì)胞焦點(diǎn)粘連通路、細(xì)胞因子受體間相互作用通路等有關(guān)。pathway富集分析的PFC作用BLI犬相關(guān)的miRNA23條，進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，為進(jìn)一步后期蛋白質(zhì)功能實(shí)驗(yàn)［如蛋白質(zhì)印記（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），免疫組化 （IHC）， 過表達(dá) （over expression），RNA 干擾（RNAi），基 因 敲 除 （knockout），轉(zhuǎn) 基 因 （transgene）等］的支持、驗(yàn)證和探討提供了數(shù)據(jù)資料，也為深入理解和研究PFC對基因表達(dá)的影響提供了分子水平的理論依據(jù)。miRNA調(diào)控基因的表達(dá)非常復(fù)雜，在不同疾病、不同組織、不同生理病理階段都不相同，而且一個(gè)miRNA標(biāo)靶許多的基因。因此，基因芯片篩選是為后續(xù)的研究提供線索和方向，明確作用機(jī)制還距離甚遠(yuǎn)。將來需要進(jìn)一步對篩選獲得的miRNA進(jìn)行QRT-PCR驗(yàn)證和靶基因預(yù)測，以完善和加強(qiáng)對miRNA在BLI中的作用及PFC可能的分子調(diào)控機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)提示，全氟化碳汽化吸入可能通過影響肺沖擊傷犬肺組織相關(guān)miRNA及其靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用。