李佳藝， 張野， 張程

1貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(貴州貴陽(yáng) 550004)； 2銅仁市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科(貴州銅仁 554300)； 3國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)肺臟免疫性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(貴州貴陽(yáng) 550002)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床上很常見(jiàn)的氣道疾病，主要包括慢性支氣管炎和肺氣腫兩種病理變化[1]。目前國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家認(rèn)為該病發(fā)病和自身免疫反應(yīng)[2-3]、氧化應(yīng)激[4]等有關(guān)，但后者在自身免疫性肺氣腫中的作用如何？目前還不清楚。鑒于氧化應(yīng)激和吸煙肺氣腫關(guān)系密切，所以，我們以大鼠為研究對(duì)象，2017年5月至2018年2月通過(guò)復(fù)制自身免疫性肺氣腫模型，檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力，以及BALF和血清中抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)的濃度，肺組織病理形態(tài)學(xué)改變等情況，旨在探討氧化應(yīng)激在自身免疫性肺氣腫中的作用，為臨床上COPD的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)SD雄性大鼠共20只，鼠齡10周，體重190～230 g。由重慶市騰鑫科技公司有償提供[許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0011，NO：0052464]。實(shí)驗(yàn)室按正常晝夜節(jié)律，室溫約25℃，騰鑫科技公司提供無(wú)菌全營(yíng)養(yǎng)飼料，飲水為飲用水。采用隨機(jī)平均分配的原則，將大鼠分為健康對(duì)照組和自身免疫性肺氣腫組，每組各10只。

1.2 藥品和試劑 臍帶首先由醫(yī)院倫理委員會(huì)備案，并由產(chǎn)婦和家庭成員同意，取自貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)科產(chǎn)婦足月分娩后的臍帶。GSH、SOD、GSH-Px、MDA及AECA測(cè)試盒為南京建成生物工程研究所供應(yīng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 我們參照路蘋(píng)[5]提取細(xì)胞方式并加以改進(jìn)用來(lái)提取人臍靜脈原代細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代及鑒定。

1.3.2 模型建立及干預(yù) 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]建立自身免疫性肺氣腫模型：4～6代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入0.25% 胰酶進(jìn)行消化，將所有細(xì)胞約1×107個(gè)重懸至1 mL后加入完全弗氏佐劑 1 mL 制備成乳狀液，予10只自身免疫性肺氣腫組大鼠腹腔注射。健康對(duì)照組10只大鼠予完全弗氏佐劑1 mL腹腔注射。在室溫20～25℃動(dòng)物房中飼養(yǎng)。

1.3.3 制備BALF及血清 參照文獻(xiàn)[7-9]，21 d時(shí)麻醉大鼠，心尖搏動(dòng)處采血離心分裝，同時(shí)制作BALF分裝，-80℃凍存。

1.3.4 測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及AECA 按試劑盒中說(shuō)明書(shū)要求測(cè)BALF中MDA濃度、SOD活力、GSH-Px活力、GSH濃度，BALF及血清中AECA濃度。

1.3.5 制作肺組織病理標(biāo)本和評(píng)估肺氣腫 參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]，制作大鼠右肺組織病理切片并進(jìn)行HE染色，計(jì)算平均內(nèi)襯間隔(MLI)及平均肺泡數(shù)(MAN)。病理組織切片均采用雙盲法讀片。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織的病理改變 健康對(duì)照組氣管壁的構(gòu)架清楚，肺泡間隔完整，肺組織構(gòu)造正常(圖1)。自身免疫性肺氣腫組肺組織切片可見(jiàn)部分區(qū)域肺泡擴(kuò)張，部分肺泡間隔變窄，肺泡間隔斷裂致使相鄰肺泡融合成較大的囊腔，這與肺氣腫顯微鏡下的變化一致(圖2)。

圖1 健康對(duì)照組肺組織(HE，×400)

圖2 自身免疫性肺氣腫組肺組織(HE，×400)

2.2 兩組大鼠MLI及MAN比較 自身免疫性肺氣腫組MLI較健康對(duì)照組增加，MAN較健康對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

項(xiàng)目n MLI(×10-6 m/個(gè))MAN(×106個(gè)/m2)健康對(duì)照組1091.12±4.64231.78±17.56自身免疫性肺氣腫組10266.73±27.20?74.43±11.85?P值<0.05<0.05

*與健康對(duì)照組比較P<0.05

2.3 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及AECA的比較 BALF中自身免疫性肺氣腫組GSH濃度、GSH-Px、SOD活力較健康對(duì)照組降低，MDA濃度較健康對(duì)照組升高，BALF及血清中自身免疫性肺氣腫組AECA濃度較健康對(duì)照組升高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

項(xiàng)目例數(shù)GSH(μmol/L)MDA(nmol/mL)GSH-Px活力SOD活力血清AECA(ng/mL)BALF中AECA(ng/mL)健康對(duì)照組10331.54±31.890.28±0.0342.12±5.5038.34±3.8059.97±3.6454.86±2.63自身免疫性肺氣腫組10182.26±31.61?1.81±0.06?18.45±4.50?16.18±2.19?90.64±6.72?86.69±3.36?P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

*與健康對(duì)照組比較P<0.05

3 討論

AECA是對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有特異性的抗體[10]，可以誘導(dǎo)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，在多種自身免疫疾病中均可檢測(cè)出[11-14]，故學(xué)者提出AECA可能參與了自身免疫性疾病的發(fā)生[15-16]。近年來(lái)，有越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，在COPD患者的血中均檢測(cè)出AECA[17-19]，并且AECA在血液中的濃度與COPD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[20]。此外，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[6]，自身免疫性肺氣腫的動(dòng)物模型中可以檢出AECA，提示AECA可能參與自身免疫性肺氣腫的形成[1,21]。

我們通過(guò)向大鼠腹腔內(nèi)注射人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，旨在建立自身免疫性肺氣腫模型。結(jié)果顯示：自身免疫性肺氣腫組血清及BALF中AECA的含量較健康對(duì)照組升高，同時(shí)病理改變顯示自身免疫性肺氣腫組肺泡部分?jǐn)U張，部分肺泡隔狹窄，肺泡隔斷開(kāi)導(dǎo)致相鄰肺泡融合成較大囊腔。通過(guò)測(cè)定 MLI及MAN的值，發(fā)現(xiàn)自身免疫性肺氣腫組 MLI較健康對(duì)照組增加，MAN較健康對(duì)照組減少，說(shuō)明此次成功地建立了自身免疫性肺氣腫模型。

氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體組織、細(xì)胞等產(chǎn)生的損傷是因?yàn)楫a(chǎn)生的多種自由基過(guò)量，從而使機(jī)體清除氧化物的負(fù)荷過(guò)重致使氧化體系和抗氧化體系失衡[22-23]。其中氧化系統(tǒng)中包含有MDA，抗氧化系統(tǒng)中包含有GSH、SOD、GSH-Px[24]。有文獻(xiàn)報(bào)道[25]，吸煙誘導(dǎo)形成的肺氣腫小鼠模型，其SOD活性及MDA均較正常組升高，考慮SOD活性增強(qiáng)與肺氣腫形成后機(jī)體代償相關(guān)，但不能完全清除自由基，機(jī)體氧化、抗氧化體系出現(xiàn)失衡，發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)多MDA。

既然氧化應(yīng)激與吸煙肺氣腫有相關(guān)性，那么氧化應(yīng)激是否與自身免疫性肺氣腫也有關(guān)聯(lián)呢？本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)GSH、MDA、SOD、GSH-Px的檢測(cè)，了解氧化應(yīng)激與自身免疫性肺氣腫的關(guān)系。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)自身免疫性肺氣腫組BALF中的MDA濃度高于健康對(duì)照組，GSH濃度、SOD及GSH-Px活力較健康對(duì)照組降低。由以上數(shù)據(jù)我們可以得出，自身免疫性肺氣腫組BALF中的MDA濃度升高，GSH濃度及SOD、GSH-Px活力降低提示此時(shí)大鼠體內(nèi)氧化程度升高，存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，上述指標(biāo)均參與大鼠自身免疫性肺氣腫的形成，從而提示氧化應(yīng)激對(duì)自身免疫性肺氣腫的形成有重要作用。