楊均均， 馮淵， 李德衛(wèi)

南充市中心醫(yī)院(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院) 1感染科, 2肝膽外科(四川南充 637000); 3重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科(重慶 400016)

肝細(xì)胞移植是治療急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)和代謝性疾病的有效方法之一，并在臨床上取得了一定的療效[1-2]。然而目前供體的嚴(yán)重短缺、肝細(xì)胞大規(guī)模增殖困難和不能長久維持其功能限制肝細(xì)胞移植在臨床中廣泛運(yùn)用[3]。在肝臟受到急慢性損傷的條件下，可以誘導(dǎo)肝臟分泌一些細(xì)胞因子刺激移植到體內(nèi)的肝細(xì)胞增殖和發(fā)揮其功能[4-5]。在肝臟無損傷的情況下，移植的肝細(xì)胞增殖能力和分泌功能較弱[6-8]。目前脾臟是肝細(xì)胞移植運(yùn)用較多、最為成熟的部位之一，但關(guān)于脾內(nèi)移植肝細(xì)胞功能和增殖情況卻少有報(bào)道[9]。我們于2016年2月至2017年9月開展本實(shí)驗(yàn)研究D-氨基半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)大鼠ALF后，經(jīng)脾臟移植同種異體肝細(xì)胞進(jìn)行治療，觀察ALF大鼠的肝功能變化情況、脾內(nèi)肝細(xì)胞功能和增殖情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 45只SD大鼠，雌雄各半，體重(200±25)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)條件：20～25℃，充足的水和食物，12 h晝夜交換。膠原酶Ⅳ、牛血清白蛋白(美國Sigma公司)，D-gal(重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室)，兔抗大鼠白蛋白單克隆抗體(美國Abcom公司)，CFDA SE (上海碧云天生物公司)，D-Hank′s、Hank′s液(北京solarbio公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝細(xì)胞分離技術(shù) 原代肝細(xì)胞的分離采用改良兩步法[10]。(1)先通過門靜脈途徑插管灌注D-Hank′s液，去除肝臟內(nèi)的紅細(xì)胞；(2)換用含0.05%膠原酶Ⅳ的Hank′s液門靜脈灌注，消化肝細(xì)胞。將分離出的肝細(xì)胞和Hank′s液制成肝細(xì)胞懸液，取出小部分肝細(xì)胞通過臺盼藍(lán)染色，觀察肝細(xì)胞的活性。

1.2.2 肝細(xì)胞熒光染料標(biāo)記 將肝細(xì)胞重懸于含有10 μmol/L 示蹤劑CFDA SE的 Hank′s液中，0℃孵育15 min,使細(xì)胞重吸收示蹤劑。通過熒光顯微鏡檢測肝細(xì)胞的標(biāo)記情況，染色成功后棄上清液，再次加入4℃ Hank′s 液，制成肝細(xì)胞懸濁液。

1.2.3 ALF大鼠模型的建立 A、B組各20只SD大鼠腹腔內(nèi)注射D-gal(劑量為0.8 g/kg)，誘導(dǎo)ALF。

1.2.4 肝細(xì)胞移植 A組SD大鼠通過3%的水合氯醛腹腔麻醉后，腹部正中線切口，暴露脾臟，臨時(shí)阻斷脾臟動(dòng)、靜脈10 min，用1 mL注射器將0.4 mL Hank′s液注入脾臟，為了防止肝細(xì)胞漏和出血，用6-0細(xì)線結(jié)扎穿刺點(diǎn)。B組SD大鼠經(jīng)D-gal(劑量為0.8 g/kg)誘導(dǎo)ALF 24 h后，通過同樣的辦法注射0.4 mL(約2×107個(gè))肝細(xì)胞懸濁液。

1.3 監(jiān)測指標(biāo)

1.3.1 肝功能檢測 分別在移植前1 d和移植當(dāng)天，隨機(jī)抽取3只SD大鼠通過尾靜脈采血觀察血清中ALT和總膽紅素(T-BiL)，觀察肝衰竭模型的建立。分別在移植后第1、5、10、15天通過尾靜脈采血觀察大鼠的肝功能變化情況，使用賴氏法檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，用溴甲酚綠法檢測T-BiL，觀察不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝功能的變化情況。

1.3.2 熒光標(biāo)記檢測 在移植術(shù)后7 d，取下熒光標(biāo)記受體大鼠的脾臟、肝臟、肺葉送快速冰凍，6 μm厚度連續(xù)切片。使用60%甘油封片后，使用熒光顯微鏡觀察CFDA SE標(biāo)記的移植肝細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。

1.3.3 白蛋白免疫熒光檢測 (1)將取下的大鼠脾臟組織送快速冰凍，連續(xù)6 μm切片；(2)凍冰切片的組織使用4%多聚甲醛固定；(3)使用PBS水化凍冰組織2次，每次約10 min；(4)使用3% BSA常溫封閉約30 min；(5)加入Ⅰ抗兔抗大鼠白蛋白單克隆抗體孵育2 h，避光；(6)再次使用PBS水化組織2次，約10 min。(7)最后使用60%甘油封片，共聚熒光顯微鏡觀察白蛋白熒光信號。

1.3.4 組織學(xué)檢測 取下的脾臟用4%的多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片，使用蘇木素-伊紅染色(HE)觀察移植肝細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞分離及熒光標(biāo)記 原代肝細(xì)胞分離成功為單個(gè)細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色活力為80%～85%。見圖1。熒光標(biāo)記見圖2。

存活肝細(xì)胞顯透亮不被臺盼藍(lán)著色，而壁破壞的肝細(xì)胞則染成藍(lán)色，白細(xì)胞色箭頭表示存活大肝細(xì)胞；藍(lán)色箭頭表示細(xì)胞壁破壞的肝細(xì)胞、死亡的肝細(xì)胞

圖1分離的肝細(xì)胞 (臺盼藍(lán)，×200)

白色箭頭為被CFDA SE熒光的肝細(xì)胞

2.2 肝功能檢測 移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的肝功能比較發(fā)現(xiàn)，在移植后第5天開始，B組ALT、T-BiL明顯低于A組(P<0.05)。在第10天左右，B組大鼠的肝功能基本恢復(fù)正常，而A組大鼠的肝功能14 d恢復(fù)正常。見表1。

2.3 組織熒光標(biāo)記 通過熒光顯微鏡，在脾臟發(fā)現(xiàn)CFDA SE標(biāo)記的肝細(xì)胞散在綠色熒光。同時(shí)肝臟也發(fā)現(xiàn)少量的綠色熒光標(biāo)記。肺部和其他部位尚未發(fā)現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的肝細(xì)胞。移植后第7天脾臟內(nèi)可觀察到CFDA SE熒光標(biāo)記的肝細(xì)胞。見圖3。

時(shí)間組別ALT(IU/L)T-BiL(mol/L)移植術(shù)后1 d A組959.0±120.564.1±9.0B組707.7±70.058.5±5.1移植術(shù)后5 dA組559.0±82.543.9±7.3B組340.7±104.0?31.2±1.4?移植術(shù)后10 dA組97.7±33.732.1±7.2B組38.3±14.5?17.9±2.1?移植術(shù)后14 dA組35.7±16.514.2±7.4B組33.3±11.811.2±2.0

*與A組同時(shí)間點(diǎn)比較P<0.05

圖3 移植后第7天脾臟CFDA SE熒光標(biāo)記的肝細(xì)胞(×200)

2.4 白蛋白免疫熒光檢測 B組移植術(shù)后60 d，白蛋白免疫熒光發(fā)現(xiàn)大量的綠色熒光標(biāo)記。見圖4。

圖中藍(lán)色代表細(xì)胞核，綠色代表白蛋白

2.5 脾內(nèi)肝細(xì)胞增殖情況 光鏡下，B組移植術(shù)后7 d，脾臟紅髓中發(fā)現(xiàn)許多HE染色較紅的肝細(xì)胞，胞漿豐富，圓形或橢圓形核位于中央，還可見雙核，核膜清楚，核仁 1～2個(gè)。部分肝細(xì)胞周圍有炎癥細(xì)胞侵潤，可以發(fā)現(xiàn)少量壞死區(qū)，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核消失。見圖5。60 d后發(fā)現(xiàn)被脾臟俘獲肝細(xì)胞簇集在一起，3、4個(gè)肝細(xì)胞形成細(xì)胞群，在脾臟紅髓中安定下來。肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)均正常，周圍未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。脾臟髓質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，仍可以發(fā)現(xiàn)一些陳舊性的壞死組織。見圖6。

白色箭頭指示為在脾臟髓質(zhì)周圍存活的肝細(xì)胞

白色箭頭指示為在脾臟髓質(zhì)周圍增殖的肝細(xì)胞

3 討論

在很多情況，肝細(xì)胞移植的增殖情況很難通過精確且無創(chuàng)的方法進(jìn)行檢查[5]。目前通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)熒光蛋白和熒光染色來追蹤移植肝細(xì)胞的增殖情況。Koblihov等[8]通過熒光掃描可以觀察移植的熒光標(biāo)記的肝細(xì)胞，從而分析其短期增殖情況，但該技術(shù)只能作為短時(shí)間的追蹤，由于半衰期的影響，遠(yuǎn)期觀察效果較差，無法觀察較長時(shí)間肝細(xì)胞的增殖情況。

CFDA SE可以通透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，使整個(gè)細(xì)胞漿發(fā)出綠色熒光。通過CFDA SE示蹤劑可以觀察移植的肝細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。移植后7 d，脾內(nèi)和肝臟內(nèi)都發(fā)現(xiàn)散在的綠色熒光標(biāo)記，說明移植的肝細(xì)胞在脾臟和肝臟 “定居”。但CFDA SE由于半衰竭的原因，無法通過熒光染色長時(shí)間的觀察。研究認(rèn)為肝刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)為大鼠肝臟及部分切除后的再生肝細(xì)胞中首次分離得到, 由于其具有特異性刺激肝細(xì)胞增殖的特點(diǎn), 故謂之肝刺激因子。肝細(xì)胞移植提高生存率的主要機(jī)制包括提供暫時(shí)的肝功能支持,以及可通過產(chǎn)生肝細(xì)胞生長因子(HGF)促進(jìn)殘存肝臟的再生和功能恢復(fù)[11-12 ]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)B組大鼠肝功能恢復(fù)好于A組。白蛋白是肝細(xì)胞特異性表達(dá)的功能蛋白，是成熟肝細(xì)胞的功能指標(biāo)，其表達(dá)數(shù)量可以直接反應(yīng)移植肝細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。移植60 d后，B組白蛋白綠色熒光信號陽性表達(dá)，HE染色發(fā)現(xiàn)B組移植的肝細(xì)胞被脾臟俘獲簇集在一起，然后分布紅髓中“安家落戶”，說明移植的肝細(xì)胞在脾臟內(nèi)增殖并發(fā)揮分泌白蛋白等生理功能作用。

關(guān)于原代肝細(xì)胞在脾內(nèi)長期功能表達(dá)和增殖情況一直存在爭議。許多研究認(rèn)為在肝功能損傷的肝硬化、肝葉切除等動(dòng)物模型中，肝細(xì)胞移植在脾內(nèi)能長時(shí)間增殖并能分泌白蛋白[13-14]。相反，有研究認(rèn)為在失代償性肝硬化大鼠中，肝細(xì)胞脾內(nèi)移植只能發(fā)揮短暫肝功能支持，移植一段時(shí)候后，脾內(nèi)肝細(xì)胞失去其正常功能[14]。造成這種爭論的原因可能與肝硬化動(dòng)物模型嚴(yán)重程度(門脈高壓、脾臟內(nèi)淤血水腫)不同有關(guān)，直接影響了脾內(nèi)移植的肝細(xì)胞長期增殖情況。

本實(shí)驗(yàn)表明ALF肝功能恢復(fù)之后，移植的肝細(xì)胞在脾內(nèi)能長期增殖并發(fā)揮功能作用，其原因可能包括以下幾個(gè)方面： (1)大鼠發(fā)生ALF之后，可以刺激肝臟分泌HGF、肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration, ALR)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-α等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)移植的肝細(xì)胞增殖和發(fā)揮功能作用[12]。(2)ALF時(shí)機(jī)體的免疫功能下降，對移植的細(xì)胞排斥反應(yīng)降低，減少脾內(nèi)移植肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞的吞噬作用等[15-16]。(3)移植后長時(shí)間的增殖能力可能與原代肝細(xì)胞分離的純度有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)的原代肝細(xì)胞提取方法，獲得較高的肝細(xì)胞純度，分離純度越高，誘發(fā)急性排斥反應(yīng)的可能性越小。(4)原代肝細(xì)胞分離的活性，直接影響移植后的肝細(xì)胞增殖情況，如肝細(xì)胞活性較低，巨噬細(xì)胞會(huì)吞噬死亡的肝細(xì)胞，從而誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)，分泌大量炎癥介質(zhì)，影響存活肝細(xì)胞的增殖，本實(shí)驗(yàn)在原代肝細(xì)胞分離過程中，得到了較高的肝細(xì)胞活性較高，從而長時(shí)間在脾內(nèi)發(fā)揮其增殖能力和發(fā)揮其功能[15]。

綜上所述， 同種異體肝細(xì)胞移植能改善ALF的肝功能，并能在脾內(nèi)60 d后仍具有一定的增殖能力和發(fā)揮白蛋白分泌功能，為臨床運(yùn)用脾內(nèi)肝細(xì)胞移植治療ALF提供了理論依據(jù)。