王官峰， 陳如， 馬鋒， 羅居?xùn)|

1三二〇一醫(yī)院泌尿外科(陜西漢中 723000)； 2常州市第二人民醫(yī)院腫瘤科(江蘇常州 213000)

膀胱癌屬于泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，在臨床上較為常見，其發(fā)病位置位于膀胱黏膜，臨床上常見的類型多樣[1]。膀胱癌常發(fā)病的人群是中老年人群，男性患病人數(shù)顯著高于女性，近年來研究數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌患病人數(shù)在逐年上升，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[2]。膀胱癌患者的臨床表現(xiàn)主要有：血尿，出現(xiàn)膀胱刺激征，且伴有間歇性，但是具有無痛性。臨床上治療膀胱癌主要采取手術(shù)、放化療、免疫治療等手段，膀胱癌如果做到早期及時治療，可以有效降低患者的病死率。膀胱癌的病因復(fù)雜，既有遺傳因素又有環(huán)境因素的影響。多數(shù)患者病因一般是因為經(jīng)常與苯胺、二氨基聯(lián)苯和芳香胺類化學(xué)物質(zhì)密切接觸有關(guān)[3-4]。2017年4月至2018年5月，本研究通過建立膀胱癌大鼠模型，采用含有苦參堿的藥物對其進行治療，探討苦參堿對膀胱癌大鼠前列腺素脫氫酶(prostaglandin dehydrogenase，PGDH)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)以及細(xì)胞膜磷脂酶A2(cytosolic phospholipasesA2，cPLA2)表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 研究動物 選擇SD健康雌性大鼠60只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。其年齡6～10周齡，平均(8.1±0.5)周齡，體重20～27 g,平均(24.4±2.6)g，飼養(yǎng)溫度22～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時進行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂給標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許它們自由活動，飼養(yǎng)時間為1周。本研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 苦參堿購自天根生化科技有限公司；N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝基胺(BBN)購自Invitrogen公司；塞來昔布購自Dako公司；甲醛溶液中性固定液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；磷酸緩沖鹽溶液購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蘇木素伊紅購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化試劑盒購自Gibco公司；小鼠抗大鼠環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、cPLA2及PGDH抗體購自Sigma公司；兔抗人COX-2、cPLA2及PGDH購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模及分組處理 將60只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、實驗組和空白組，每組各20只。模型組、實驗組兩組大鼠采取灌胃的形式服用致癌劑BBN，劑量200 mg/mL，給藥時間是下午16～18點，連續(xù)灌胃8周。實驗組大鼠給予苦參堿灌胃治療，空白組和實驗組兩組大鼠給予等體積的生理鹽水，灌胃，1 d/次，用藥時間上午7～9點，連續(xù)治療35周。

1.3.2 膀胱組織的處理 膀胱癌大鼠在35周進行稱重后處死，后將膀胱完整取出后，使用4%多聚甲醛固定進行解剖。經(jīng)過石蠟包埋，使用HE染色。

1.3.3 雙抗體夾心法檢測cPLA2、VEGF、PGDH表達水平 將待測血清采用雙抗體夾心法對3組大鼠的cPLA2、VEGF、PGDH進行檢測，將待測血清吸附在微量滴板的小孔里進行洗滌，加入待測抗原，如果兩者是特異的，則會產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，把多出來的抗體洗除，然后加入與待測抗原中呈現(xiàn)出特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，使其形成“夾心”現(xiàn)象，接著加入該酶的底物，如果能看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，則說明在孔壁上存在著相對應(yīng)的抗原，從而通過顯色后讀取濃度的具體數(shù)據(jù)來計算出cPLA2、VEGF、PGDH的表達水平。

1.3.4 TUNEL法檢測膀胱癌細(xì)胞凋亡 將采集的標(biāo)本細(xì)胞傳代到6孔板中，置于溫度為37℃，濃度為5%的二氧化碳的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h，加入濃度為0.25%的胰蛋白酶進行消化，用離心機以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后收取細(xì)胞，然后使用PBS緩沖液洗滌3 min，重復(fù)洗滌2次，再次用離心機以 2 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離后收集細(xì)胞，加入1 mL PI染液，在避光的常溫環(huán)境中放置1 h后，然后用特異熒光標(biāo)記后，在鞘液包裹下高速流動中，流動期間會發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀檢測，利用發(fā)光信號測量儀檢測光子數(shù)值，檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western blot檢測p16INK4a抑制CyclinD1及CDK4表達水平 使用PBS緩沖液將采集到的細(xì)胞清洗3遍以上，分離緩沖液，再加入IP細(xì)胞裂解液，進行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4℃的環(huán)境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液清洗反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其僅在底物溶液中進行顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，腫瘤發(fā)生率采用2檢驗或Fisher確切概率法比較。計量資料采用描述，組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠病理組織學(xué)觀察 空白組大鼠膀胱細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞黏膜之間表現(xiàn)光滑，平整，細(xì)胞間質(zhì)之間并未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞的浸潤；模型組大鼠膀胱癌細(xì)胞纖細(xì)、出現(xiàn)較多的分支，細(xì)胞排列雜亂，體積差異很大，異型性明顯；實驗組大鼠膀胱癌細(xì)胞間質(zhì)之間出現(xiàn)水腫、伴有大量的充血、發(fā)現(xiàn)有淋巴細(xì)胞的浸潤，部分癌細(xì)胞開始侵犯黏膜固有層以及肌層。見圖1。

A：空白組；B：模型組；C：實驗組

2.2 3組大鼠cPLA2、VEGF、PGDH相對蛋白表達量比較 空白組和實驗組PGDH表達水平顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組VEGF水平顯著高于實驗組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組cPLA2水平顯著高于實驗組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

項目nPGDHVEGFcPLA2空白組201.00±0.011.00±0.011.00±0.01模型組200.28±0.042.05±0.131.95±0.12實驗組200.91±0.031.08±0.051.10±0.05F值117.1454.0252.92P值<0.05<0.05<0.05

2.3 3組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 空白組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于實驗組和模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組大鼠腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)高于實驗組和空白組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

項目n腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)空白組203.46±0.433.35±0.45模型組2010.75±1.4317.86±3.12實驗組2016.53±2.2510.33±1.29F值12.0342.42P值<0.05<0.05

2.4 3組大鼠p16INK4a、CyclinD1、CDK4蛋白的表達比較 實驗組大鼠通過p16INK4a蛋白表達上調(diào)，從而抑制了CyclinD1及CDK4表達，p16INK4a表達下降，CyclinD1及CDK4的表達則升高。3組實驗數(shù)據(jù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

項目np16INK4aCyclinD1CDK4空白組200.58±0.200.20±0.140.17±0.16模型組200.30±0.180.63±0.220.91±0.31實驗組200.45±0.200.39±0.240.65±0.37F值6.8911.0614.23P值<0.05<0.05<0.05

3 討論

臨床上手術(shù)治療膀胱癌廣泛采取內(nèi)鏡和膀胱內(nèi)治療，并且成效顯著，但出現(xiàn)復(fù)發(fā)的膀胱癌患者仍有50%～70%，其中進展到浸潤期的患者占10%～30%，造成患者死亡的主要原因便是浸潤性膀胱癌。肌層浸潤性膀胱癌惡性程度高，進展快，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后比較差，5年生存率僅約25%[5-6]。

苦參堿屬于四環(huán)喹嗪啶類化合物的天然生物堿，主要是從苦參中提煉出來?？鄥A臨床上常用來治療腫瘤疾病，主要具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，同時可以抵抗病毒，促進免疫調(diào)節(jié)，避免心率失常和感染發(fā)生[7]。研究顯示[8-9]，苦參堿對膀胱癌EJ細(xì)胞的生長和發(fā)育起到干擾作用，其作用機制是：通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達，促進EJ細(xì)胞凋亡；經(jīng)過不同濃度的苦參堿干擾膀胱癌BIU-87細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)苦參堿對其細(xì)胞周期有阻滯作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]?？鄥A影響膀胱癌體外實驗研究較多，但是相關(guān)的體內(nèi)研究實驗少，本研究主要通過建立膀胱癌大鼠模型，研究苦參堿治療膀胱癌的效果及相關(guān)作用機制。本研究應(yīng)用的致癌試劑是BBN，優(yōu)勢是BBN可以口服，具有較強的特異性和較高的致癌率[11]。

在前列腺素生成、降解的過程之中，cPLA2、PGDH發(fā)揮著較為關(guān)鍵的作用[12]。前列腺素主要是由花生四烯酸(AA)轉(zhuǎn)化形成產(chǎn)生的，而AA主要是由cPLA2催化細(xì)胞分泌產(chǎn)生，從而參與前列腺素的產(chǎn)生以及疾病發(fā)展過程。有學(xué)者通過研究表明，cPLA2與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，包括前列腺癌、膀胱癌等[13-14]。在前列腺素生成以后，PGDH可以將其氧化降解，使它原有的生物活性大幅度降低，大量的研究表明，PGDH是一種重要的抑癌基因，在大部分腫瘤組織中呈現(xiàn)異常低表達甚至不表達。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠cPLA2水平較高，PGDH水平較低，說明苦參堿能夠抑制前列腺素的生成，降低其生物活性，從而抑制腫瘤組織的發(fā)展，對cPLA2、PGDH水平進行調(diào)控。

VEGF可以促進血管的生長和發(fā)育，還可以通過調(diào)控病理性血管發(fā)生和增加血管通透性而起作用，在膀胱癌、胰腺癌、直腸癌等各類腫瘤組織中，均有高水平的VEGF表達。VEGF能夠參與腫瘤營養(yǎng)血管的發(fā)生和構(gòu)建,刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進血管內(nèi)的物質(zhì)外滲,可以為腫瘤的生長和發(fā)育、浸潤和遷移提供適宜的環(huán)境條件[16]。

模型組PGDH相對蛋白表達量顯著低于實驗組和空白組，模型組VEGF相對蛋白表達量顯著高于實驗組和空白組，模型組cPLA2相對蛋白表達量顯著高于實驗組和空白組；空白組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于實驗組和模型組，實驗組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)高于模型組；腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)模型組大鼠高于實驗組和空白組大鼠，實驗組大鼠p16INK4a蛋白表達水平明顯高于實驗組和模型組。

p16INK4a是一種抑癌基因，膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與其有著重要關(guān)系，p16INK4a可以抑制CyclinD1/CDK4復(fù)合物的發(fā)揮[17-18]。p16INK4a是重要的調(diào)節(jié)因子，其通過與CyclinD1結(jié)合，對CyclinD1和CDK4結(jié)合有抑制作用，阻止CyclinD1-CDK4相關(guān)復(fù)合物的生成，對刺激酶有抑制效果，Rb蛋白不能進行磷酸化，其與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合可以有效抑制Rb蛋白的活性，達到抑制細(xì)胞增殖的效果[19]。p16INK4a/CyclinD1/CDK4是細(xì)胞周期中重要的調(diào)控通路，在調(diào)控G1/S檢測點起到關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控作用。研究數(shù)據(jù)顯示，p16INK4a蛋白水平下調(diào)，以及l(fā)inD1和CDK4蛋白出現(xiàn)過表達，和p16INK4a/CyclinD1/CDK4通路有緊密聯(lián)系，影響膀胱癌的分級導(dǎo)致其復(fù)發(fā)[20]。本研究顯示，膀胱癌大鼠p16INK4a表達下降，CyclinD1和CDK4的表達升高，經(jīng)過苦參堿干預(yù)，膀胱癌大鼠p16INK4a表達上升，CyclinD1和CDK4的表達下降。說明苦參堿對p16INK4a、CyclinD1和CDK4蛋白有顯著的抑制作用。分析原因：苦參堿通過激活p16INK4a/CyclinD1/CDK4通路，調(diào)控細(xì)胞周期，對p16INK4a表達起抑制作用是為了破壞介導(dǎo)效果，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進其細(xì)胞凋亡。

綜上所述，苦參堿具有能夠使膀胱癌大鼠cPLA2降低，PGDH相對蛋白表達量提高的作用，還可以提高腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)，降低腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)。本次實驗為臨床中膀胱癌的治療和預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。