岑梓文， 陳芙蓉， 王靜， 柯超， 陳銀生， 陳忠平△， 馮冰虹

1廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院(廣東廣州 510006)； 2中山大學(xué)腫瘤防治中心、華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心神經(jīng)外科/神經(jīng)腫瘤科(廣東廣州 510060)

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)腦腫瘤，呈彌漫性、浸潤(rùn)性增長(zhǎng)，預(yù)后一般，高級(jí)別的膠質(zhì)瘤容易復(fù)發(fā)[1]。越來(lái)越多的研究表明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cell，GSCs)在腫瘤發(fā)生、維持、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)以及耐藥過(guò)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[2]。GSCs能對(duì)抗膠質(zhì)瘤的治療，是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個(gè)特定亞群，具有腫瘤干細(xì)胞的特性，如無(wú)限的自身克隆能力，分化和對(duì)化療和放療的抵抗力，并表現(xiàn)出非常強(qiáng)的DNA修復(fù)能力[3]。GSCs高度表達(dá)CD133、Sox2和Nestin腫瘤干性等分子標(biāo)志物[4]。Hossain等[5]的研究表明，腫瘤性間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是膠質(zhì)瘤中的潛在的新基質(zhì)成分，可驅(qū)動(dòng)GSCs的侵襲性，抑制MSCs的生長(zhǎng)是膠質(zhì)瘤治療中的一種新型靶點(diǎn)。還有Lim等[6]的研究表明，腫瘤源性MSCs與GSCs共培養(yǎng)能增強(qiáng)其耐藥性，它對(duì)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展有著促進(jìn)的作用。為了研究GSCs和MSCs在膠質(zhì)瘤中促進(jìn)生長(zhǎng)、耐藥等問(wèn)題中的作用和機(jī)制，必須先分離篩選這類(lèi)細(xì)胞。在此，我們收集多例高級(jí)別膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本，成功進(jìn)行GSCs和MSCs的原代培養(yǎng)，并詳細(xì)介紹了GSCs與MSCs的鑒定方法及結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料 2017年3月至2019年3月期間，我們共對(duì)取自中山大學(xué)腫瘤防治中心的62例高級(jí)別膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行GSCs和MSCs的原代培養(yǎng)。手術(shù)標(biāo)本對(duì)應(yīng)患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)影像學(xué)和術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)瘤，WHO Ⅲ級(jí)及以上；(2)原發(fā)性或繼發(fā)性膠質(zhì)瘤；(3)年齡18歲及以上，男女不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV陽(yáng)性。

BALB/c-nu裸鼠，4周齡，18～22 g，雌性，由北京維通利華公司提供，于中山大學(xué)(北校區(qū))動(dòng)物中心SPF條件飼養(yǎng)。本研究獲得患者的知情同意，取得了倫理委員會(huì)對(duì)開(kāi)展相關(guān)人體以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的批準(zhǔn)，并遵循中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用的規(guī)定。

1.2 主要試劑 (1)GSCs培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，2%神經(jīng)元細(xì)胞添加劑B-27(Gibco，美國(guó))、20 ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)(PeproTech，美國(guó))及20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)(PeproTech，美國(guó))；(2)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基：含L-谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基(Corning，美國(guó))，10%胎牛血清(FBS)(Corning，澳大利亞)；(3)其他：Ⅱ型膠原酶(Invitrogen，美國(guó))，干細(xì)胞消化酶(Accutase)(Corning，美國(guó))，0.25%胰酶(Gibco，中國(guó))，纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)ib)(Corning，美國(guó))，小鼠抗人CD133、GFAP、Ⅲ β-tubulin、Nestin和兔抗人Sox-2抗體(Abcam，美國(guó))，間充質(zhì)干細(xì)胞三系分化試劑盒(Lonza，美國(guó))，茜素紅染液，阿利斯藍(lán)染液和油紅O染液(谷歌生物，中國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng) 手術(shù)臺(tái)上取新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本，冰上運(yùn)輸至超凈臺(tái)里，使用滅菌消毒后的眼科剪刀將標(biāo)本剪碎至糊狀，生理鹽水輕輕漂洗；去上清后加入Ⅱ型膠原酶，置于37℃培養(yǎng)箱消化，適時(shí)吹打均勻直到大部分組織塊狀物溶解消失為止，加入含血清培養(yǎng)基終止消化后將70 μm的細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)篩，分成2份，400×g離心后去掉上清。分別加入GSCs培養(yǎng)基和MSCs培養(yǎng)基，重懸得單細(xì)胞懸液并種板于培養(yǎng)皿；48 h后更換培養(yǎng)基，顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度，適時(shí)傳代。GSCs使用干細(xì)胞消化酶消化傳代，MSCs使用0.25%胰酶消化傳代。

1.3.2 GSCs的免疫熒光鑒定 取GSCs種于已涂布Fib的24孔板；過(guò)夜貼壁后4%多聚甲醛固定，山羊血清封閉，分別孵育CD133、GFAP、Ⅲ β-tubulin、Nestin和Sox-2一抗過(guò)夜；PBS洗3次后避光孵育對(duì)應(yīng)種屬的熒光二抗；PBS洗3次后染DAPI；加入防淬滅試劑后于熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像。

1.3.3 GSCs的成瘤鑒定 取生長(zhǎng)良好，光澤通亮的GSCs，加入干細(xì)胞消化酶為單細(xì)胞懸液，顯微計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL；取0.1 mL皮下注射于裸鼠腋下，注射細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/只裸鼠，共3只裸鼠，觀察腫瘤出現(xiàn)時(shí)間，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小。

1.3.4 MSCs的三系分化鑒定 取生長(zhǎng)良好的MSCs，0.25%胰酶消化，終止消化后種板于24孔板；過(guò)夜貼壁后換液，分別加入成骨、成軟骨、成脂肪條件分化培養(yǎng)基，分別設(shè)立對(duì)照組，為MSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換液；4周后，去除培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，成骨組加入茜素紅染色，成軟骨組加入阿利斯藍(lán)染色，成脂肪組加入油紅O染色5 min，對(duì)照組亦分別染色；PBS洗3次后，顯微觀察并拍攝圖片。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)結(jié)果 在62例手術(shù)標(biāo)本中， WHO Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤22例，WHOⅣ級(jí)膠質(zhì)瘤40例。能培養(yǎng)出同源GSCs和MSCs的標(biāo)本13例，均為WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤，其中病理診斷為原發(fā)性7例，繼發(fā)性6例。

2.2 GSCs和MSCs的形態(tài) GSCs為成球形態(tài)，懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞光澤明亮通透；MSCs為大部分紡錘形，小部分圓形貼壁生長(zhǎng)，與普通膠質(zhì)瘤形態(tài)類(lèi)似，偽足較長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。目前兩種細(xì)胞已經(jīng)能穩(wěn)定傳至30代，本研究實(shí)驗(yàn)使用15代以上的細(xì)胞。

2.3 GSCs的免疫熒光鑒定 本研究患者來(lái)源的細(xì)胞以GSCs選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)，目的蛋白分子使用熒光二抗(綠色)標(biāo)記。結(jié)果檢測(cè)出該細(xì)胞高度表達(dá)干性分子標(biāo)記CD133、SOX-2、Nestin，低表達(dá)分化標(biāo)記GFAP和Ⅲ β-tubulin，藍(lán)色DAPI染核。見(jiàn)圖2。

圖1 GSCs和MSCs的形態(tài)(×100)

A：CD133；B：SOX-2；C：Nestin；D：GFAP；E：Ⅲ β-tubulin；F：空白對(duì)照

2.4 GSCs的成瘤鑒定 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，皮下注射1×105原代培養(yǎng)的GSCs，3只裸鼠在6周后都形成腫瘤，最大徑為(0.7±0.3)cm。

2.5 MSCs的三系分化鑒定 鑒定結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)MSCs誘導(dǎo)分化試劑盒誘導(dǎo)后，腫瘤源性MSCs成功分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

3 討論

由于膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，血腦屏障的存在，耐藥性及容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，目前膠質(zhì)瘤的治療形勢(shì)不容樂(lè)觀[7]，因此尋求新的治療方法十分重要。越來(lái)越多的證據(jù)表明[8]，GSCs的存在是膠質(zhì)瘤難以治療的重要因素。GSCs能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境[9]，促進(jìn)腫瘤血管生成[10]等原因驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。最近的研究表明，腫瘤性MSCs通過(guò)促進(jìn)GSCs的生長(zhǎng)進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[11]。因此，研究GSCs和MSCs是研究治療膠質(zhì)瘤的重要方向。

研究GSCs和MSCs的首要步驟，需要先從腫瘤細(xì)胞中分離并篩選這類(lèi)腫瘤干細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)的方法，如膠質(zhì)瘤組織培養(yǎng)法[12]和胰酶消化法[13]等，但是這些方法只能短期培養(yǎng)而不能穩(wěn)定傳代以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。以往本實(shí)驗(yàn)室中傳統(tǒng)GSCs的原代培養(yǎng)誘導(dǎo)方法成功率比較低，2010—2016年間42例高級(jí)別(Ⅲ和Ⅳ級(jí)各半)膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本中有2例Ⅳ級(jí)成功培養(yǎng)出GSCs，成功率只有不到5%。在使用傳統(tǒng)方法對(duì)Ⅲ級(jí)或是Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞往往都會(huì)無(wú)法傳代擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)或者數(shù)代以?xún)?nèi)大部分細(xì)胞會(huì)凋亡。本研究的GSCs誘導(dǎo)成功率與傳統(tǒng)方法相比提高了4倍，超過(guò)20%。原代培養(yǎng)手段改善之處有：使用Ⅱ型膠原酶代替0.25%胰酶消化膠質(zhì)瘤組織，并且在消化過(guò)程中及時(shí)吹打，使組織與膠原酶充分接觸；使用干細(xì)胞消化酶Accutase代替0.25%胰酶在傳代時(shí)消化細(xì)胞；如遇GSCs細(xì)胞球體積較大而難以消化成單細(xì)胞時(shí)，可將GSCs球接種與涂布Fib的培養(yǎng)皿上，待GSCs球會(huì)貼壁生長(zhǎng)后輕輕吹打，可將球狀結(jié)構(gòu)吹散獲得單細(xì)胞懸液以便傳代或者凍存。GSCs的原代培養(yǎng)與誘導(dǎo)關(guān)鍵之處在于細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，胰酶對(duì)細(xì)胞蛋白的消化能力較大，而Ⅱ型膠原酶和Accutase對(duì)細(xì)胞的溫和性大大提高，減少了對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面蛋白的損傷，保證了細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。另外，我們對(duì)成功培養(yǎng)出GSCs的13例標(biāo)本進(jìn)行病理診斷分析，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤級(jí)別全部為Ⅳ級(jí)，在40例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本總數(shù)中占32.5%，因此考慮個(gè)體差異也是一個(gè)很重要的影響因素，這可能與膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)。我們得出結(jié)論，膠質(zhì)瘤的惡性程度越高，才能更容易培養(yǎng)誘導(dǎo)出GSCs。因此，并不是每一個(gè)手術(shù)標(biāo)本都能成功原代培養(yǎng)出GSCs，這可能是以往GSCs原代培養(yǎng)中失敗率比較高的重要因素。

圖3 MSCs的三系分化染色圖

MSCs的原代培養(yǎng)則比GSCs相對(duì)容易，一般來(lái)說(shuō)只要膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本適合培養(yǎng)，就能培養(yǎng)出MSCs。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)膠質(zhì)瘤源性MSCs的研究尚不多，尤其國(guó)內(nèi)關(guān)于膠質(zhì)瘤MSCs的報(bào)道頗少。國(guó)外研究表明[14]，MSCs顯示多效功能，其包括分泌具有與癌癥進(jìn)展有關(guān)的免疫抑制活性的可溶性因子，腫瘤源性的MSCs比正常組織的MSCs具有更強(qiáng)的免疫抑制性，并且影響自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)功能和表型。腫瘤源性MSCs能通過(guò)促進(jìn)GSCs生長(zhǎng)，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的對(duì)抗放療和化療的能力。因此，我們下一步的研究是MSCs和GSCs共培養(yǎng)的方向，研究MSCs如何改變GSCs的微環(huán)境，如GSCs的藥敏實(shí)驗(yàn)中，使用MSCs貼壁培養(yǎng)24 h后的上清培養(yǎng)基，再測(cè)其相關(guān)蛋白的變化。國(guó)外有新的3D細(xì)胞培養(yǎng)研究方法[15]，傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)在研究癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移以及篩選治療候選物方面具有局限性，3D培養(yǎng)系統(tǒng)可以允許細(xì)胞彼此生長(zhǎng)、遷移和相互作用，從而成為比2D平面培養(yǎng)模式更能模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀SCs除了能影響GSCs，還能調(diào)節(jié)一般腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移和耐藥性以及MSCs對(duì)膠質(zhì)瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的影響方面的致病作用，所以我們不只研究MSCs對(duì)GSCs的作用，日后還會(huì)研究MSCs與膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的作用。

本研究介紹了腫瘤源性MSCs的培養(yǎng)方法并分享了GSCs的改善培養(yǎng)方法。在62例標(biāo)本的原代培養(yǎng)中，能培養(yǎng)出同源GSCs和MSCs的有13例，成功率達(dá)20.9%。GSCs的培養(yǎng)需使用無(wú)血清培養(yǎng)基因而培養(yǎng)難度較大，但是課題組使用最新并優(yōu)化的原代培養(yǎng)技術(shù)將成功率提高。本研究不足之處在于有接近4/5的手術(shù)標(biāo)本不能成功地原代培養(yǎng)出GSCs，其可能與標(biāo)本是否高級(jí)別膠質(zhì)瘤有關(guān)，后續(xù)研究我們將手術(shù)的納入標(biāo)準(zhǔn)從WHO Ⅲ級(jí)及以上改為WHO Ⅳ級(jí)。本研究成功培養(yǎng)并鑒定出膠質(zhì)瘤源性GSCs和MSCs，為將來(lái)在此基礎(chǔ)上開(kāi)展膠質(zhì)瘤治療方法探索的研究提供基礎(chǔ)。