胡舉偉 代 欣 宋 濤 孫廣玉*

(1.金正大生態(tài)工程集團股份有限公司/養(yǎng)分資源高效開發(fā)與綜合利用國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與新型肥料創(chuàng)制重點實驗室，臨沂 276700； 2.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

光不僅是植物光合作用的能量來源，也是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子。光質(zhì)的改變可明顯影響植物生理過程、形態(tài)建成和生長發(fā)育，而光質(zhì)對植物生理過程、形態(tài)建成和生長發(fā)育的影響會因植物種類的不同而發(fā)生變化。相比于其他光譜區(qū)域，紅光和藍光可被光合色素更有效的吸收[1～2]。大量研究表明紅光、藍光、紅藍混合光均可對植物的光合作用、形態(tài)建成和生理特性產(chǎn)生不同影響[3～7]。

黑龍江省桑蠶業(yè)資源豐富，發(fā)展桑蠶業(yè)具有得天獨厚的資源和區(qū)位優(yōu)勢，夏季空氣干爽，養(yǎng)蠶季節(jié)氣溫適中，蠶發(fā)病少，繭質(zhì)優(yōu)[8]。2003年以來，黑龍江松嫩平原鹽堿土地區(qū)開始種桑養(yǎng)蠶，并逐漸大面積推廣應用。當?shù)剞r(nóng)民在技術人員的幫助下，充分利用桑樹(MorusalbaL.)的特點，發(fā)展成為養(yǎng)蠶桑樹(蠶桑)、桑葚桑樹(果桑)、畜牧飼料桑樹(飼料桑)、綠化用桑樹(綠化桑)、中藥材桑樹(藥桑)、食用桑樹(茶桑)等多種桑樹產(chǎn)品并進的農(nóng)村經(jīng)營模式，桑樹種植面積從無到有發(fā)展到約3萬畝，農(nóng)民獲得了較高經(jīng)濟效益，而且發(fā)現(xiàn)種植桑樹后鹽堿土壤pH明顯下降，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)得到了長足發(fā)展[9]。黑龍江省秋冬季較長，當?shù)剞r(nóng)民為了更好地利用冬閑季節(jié)，利用設施栽培的方法種植桑樹，發(fā)展果桑采摘桑葚能獲得更大經(jīng)濟效益；同時也在溫室中繁育桑樹幼苗出售，以滿足當前大田桑樹栽培和園林綠化的需求。但在設施栽培條件下，晚秋、冬、春等季節(jié)都不同程度地存在光照時間短、光照不足等嚴重缺光的問題，會嚴重地影響桑樹生長。因此，如何調(diào)節(jié)光照獲得健壯幼苗，以滿足大田桑樹栽培和桑樹扦插育苗的需要，成為目前需要解決的問題。藍光(400～500 nm)和紅光(600～700 nm)是對高等植物光合作用最有效的光，鑒于其光譜特性，紅藍光質(zhì)對植物的生長、光合和生理特征等方面的影響成為國內(nèi)外學者們的研究熱點，目前關于紅藍光對植物生長發(fā)育影響的研究多聚焦在蔬菜、花卉等植物，例如黃瓜(CucumissativusL.)[10]、番茄(LycopersiconesculentumMill.)[11]、菠菜(SpinaciaoleraceaL.)[12]等，關于紅藍光對桑樹生長影響的研究報道較少。同時由于植物對光質(zhì)的生理與生長響應多是物種依賴的[13]，不能根據(jù)前人研究結果推測紅藍光對桑樹生長與生理的影響。因此，有必要研究紅藍光對桑樹幼苗生長和生理特性的影響，以期探明紅藍光對桑樹幼苗生長和生理的調(diào)控作用，為設施栽培桑樹中光質(zhì)條件的調(diào)控提供參考與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)環(huán)境

試驗于2014年9月進行，供試材料為1年生桑樹品種“龍桑1號”幼苗(MorusalbaL.cv.Longsang No.1)，去掉桑樹幼苗的分枝、葉片和須根，僅保留主莖、主根各約2 cm，然后將幼苗移栽到直徑8 cm、高12 cm的培養(yǎng)盆中，培養(yǎng)盆內(nèi)裝草炭土和蛭石的混合培養(yǎng)基質(zhì)(體積比2∶1)，每盆定植1株。每株只保留一支枝條。在移栽后將所有植株放置在人工氣候室中，由白色冷熒光燈(廣州綠熒光電有限公司)提供光照，光照強度為100 μmol·m-2·s-1，環(huán)境條件控制為：光周期(14 h/10 h，光/暗)，白天溫度(28±2℃)，夜間溫度(23±2℃)，相對濕度60%～65%，每3 d澆1次水。

1.2 光質(zhì)處理方法

幼苗培養(yǎng)2周后挑選健壯、長勢一致的幼苗接受不同光質(zhì)處理。一些幼苗仍在白色冷熒光燈下培養(yǎng)，作為白光(W)對照處理，另設3個LEDs陣列光源處理，分別為紅光(R)、藍光(B)、紅藍混合光(RB)(紅光LED數(shù)量∶藍光LED的數(shù)量=5∶1)，以上LEDs陣列光源均由廣州綠熒光電有限公司提供。不同光源的光譜和光照強度通過光譜儀(OPT-2000,Optpe Co.,中國)和光量子傳感器(LI-250A,Licor,美國)測定。放置不同光源的燈架外部用遮光布覆蓋，以避免外界光照干擾。通過調(diào)整光源到植株頂部的距離，使各處理的光照強度保持在100 μmol·m-2·s-1，不同光質(zhì)的光譜特點詳見表1，其它環(huán)境條件同1.1。每處理各20盆植株，3次重復。幼苗在不同光質(zhì)處理下培養(yǎng)30 d后，選取從頂端往下數(shù)第2片完全展開葉片進行各項指標測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長指標測定

各處理均隨機選取5株幼苗，測定從植株莖基部到頂部的莖長度；用葉面積儀測定葉片面積(LI-3000C,Licor,美國)；將植株的莖、葉殺青后，在80℃下烘干至恒重，用電子天平稱量干重；根據(jù)從頂端往下數(shù)第2片完全展開葉片的葉面積、干重，計算比葉重(LMA)。

1.3.2 生化指標測定

各處理均隨機選取3株幼苗進行各項指標測定。用打孔器從新鮮葉片取圓形葉片，按照Arnon[14]所述方法測定葉綠素含量?？扇苄缘鞍缀康臏y定參照Bradford[15]的方法。

蔗糖、淀粉含量按照前人研究描述的方法測定：稱取烘干后的葉片，用25 mL 80%乙醇(V/V)研磨提取蔗糖，離心后，上清用于蔗糖含量的測定；向離心后的沉淀中加入25 mL 2% HCl(V/V)，煮沸4 h，冷卻后離心，上清用于淀粉含量的測定[16]。用打孔器從新鮮葉片上取圓形葉片，殺青后在80℃下烘干至恒重，然后取烘干后葉片，通過元素分析儀(Vario MAX CN,Elementar,德國)測定葉片總氮(N)含量。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法[17]。過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[18]。過氧化氫酶(CAT)活性通過過氧化氫還原法測定[19]。丙二醛(MDA)含量通過MDA與含有0.5%(W/V)硫代巴比妥酸的三氯醋酸溶液的反應產(chǎn)物在532 nm處吸光度測定[20]。

1.3.3 光合氣體交換參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)測定

利用LI-6400XT便攜式光合儀(Licor,美國)測定植株葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)，葉室溫度控制為28±1℃，相對濕度65%，外界CO2濃度為400 μmol·mol-1，光強為100 μmol·m-2·s-1。葉綠素熒光參數(shù)利用FMS-2葉綠素熒光儀(Hansatech,英國)測定，在測定之前先將植株暗適應30 min，試驗所用光化光和飽和脈沖光分別為100和5 000 μmol·m-2·s-1，PSⅡ的最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ的實際光化學效率(ΦPSⅡ)、開放的PSⅡ反應中心激發(fā)能的捕獲效率(Fv′/Fm′)、非光化學猝滅(NPQ)參照Wingler等[21]所述的方法測量和計算。

1.3.4 葉片解剖結構測定

用刀片切取1 mm×2 mm的葉片樣品，注意避開主葉脈，取樣后將樣品隨即放入1%戊二醛(W/V)中抽真空，而后在4%戊二醛中4℃下固定3 h。固定后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液充分沖洗樣品。然后將樣品放入2%鋨酸(W/V)中，在4℃下后固定1.5 h，之后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液充分沖洗樣品，接著樣品經(jīng)一系列不同濃度丙酮梯度脫水。脫水完成后樣品用一系列不同比例的純丙酮和環(huán)氧樹脂混合物進行滲透與包埋。包埋后，切出超薄切片(70 nm)。超薄切片用5%醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛(W/V)染色，然后用透射電鏡(Hitachi-7650,Hitachi,日本)觀察，并用透射電鏡自帶軟件測量葉片厚度、柵欄組織以及海綿組織厚度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析(one-way ANOVA)分析，并比較不同數(shù)據(jù)組間的差異(LSD, α=0.05)。采用Microsoft Excel 2007作圖，圖表中數(shù)據(jù)均為3次或3次以上重復的平均值±SD。

2 結果與分析

2.1 不同光質(zhì)的光譜特點

由表1可知，白光的峰值波長為410～700 nm，紅光LED和藍光LED的峰值波長分別為660 nm、465 nm，半峰全寬均為20 nm。

表1 不同光質(zhì)的光譜參數(shù)

Table 1 The light spectral parameters of different light quality

處理Treatments峰值波長Peak wavelength(nm)半峰全寬Halfwave width(nm)光量子通量密度Photon flux density(μmol·m2·s-1)W410～700—100R660±20100RB660,465±20,±20100B465±20100

注：W.白光；R.紅光；RB.紅藍混合光；B.藍光 下同。

Note:W.White light; R.Red light; RB.Mixture of red and blue light(red LED∶blue LED=5∶1); B.Blue light The same as below.

表2 不同光質(zhì)對桑樹幼苗生長的影響

注：同一列中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05),the same as below.

表3 不同光質(zhì)對桑樹幼苗生化指標的影響

2.2 不同光質(zhì)對桑樹幼苗生長的影響

由表2可知，不同光質(zhì)處理對桑樹植株的生長、形態(tài)特征產(chǎn)生了明顯影響。紅光處理下植株莖長、葉面積最大，其次是白光、紅藍混合光處理，在藍光處理下最小。白光對照處理下植株的莖干重、葉干重顯著高于其它光質(zhì)處理，而藍光處理下植株的莖干重、葉干重最小。藍光處理下植株的比葉重最大且顯著高于其它光質(zhì)處理，紅光處理下植株的比葉重最小。

2.3 不同光質(zhì)對桑樹幼苗生化指標的影響

如表3所示，白光對照處理下葉片的葉綠素含量最高且顯著高于紅光處理，但與紅藍混合光、藍光處理相比無顯著差異。而紅藍混合光、藍光處理下葉片的葉綠素a/b比值與對照相比無顯著差異，而紅光處理下葉片的葉綠素a/b顯著低于對照處理。藍光處理下植株的可溶性蛋白含量、葉片總N含量最高，其次是白光、紅藍混合光處理，紅光處理下最小。藍光處理下葉片的蔗糖、淀粉含量顯著高于其它光質(zhì)處理，紅光處理下葉片的蔗糖含量最低，而白光對照處理下葉片的淀粉含量最低。

圖1 不同光質(zhì)對桑樹葉片光合氣體交換參數(shù)的影響Fig.1 Effects of different light qualities on photosynthetic gas exchange parameters of mulberry leaves

圖2 不同光質(zhì)對桑樹葉片熒光參數(shù)的影響Fig.2 Effects of different light qualities on chlorophyll fluorescence parameters of mulberry leaves

圖3 不同光質(zhì)對桑樹葉片抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性及MDA含量的影響Fig.3 Effects of different light qualities on antioxidant enzymes(SOD,POD and CAT) activity and MDA content of mulberry leaves

2.4 不同光質(zhì)對桑樹幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

如圖1所示，光質(zhì)顯著影響葉片的光合特性(圖1)。與白光對照處理的葉片Pn相比，紅光和藍光處理下葉片的Pn顯著降低，且紅光處理下葉片的Pn最低，紅藍混合處理下葉片的Pn與對照處理相比，無顯著差異。同時，藍光處理下葉片的Gs顯著高于其它各光質(zhì)處理，而紅光處理葉片的Gs顯著低于其它各光質(zhì)處理，紅藍混合光處理下葉片的Gs與白光對照相比無顯著差異。

2.5 不同光質(zhì)對桑樹幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

如圖2所示，與白光對照相比，紅藍混合光對葉片的Fv/Fm無顯著影響，而紅光、藍光處理下葉片的Fv/Fm顯著降低且紅光下降低的程度最大。不同光質(zhì)對ΦPSⅡ的影響與Fv/Fm相似。與白光對照相比，紅光、紅藍混合光和藍光處理下葉片的Fv′/Fm′顯著降低，且紅光處理下葉片的Fv′/Fm′最低，紅藍混合光處理的Fv′/Fm′顯著高于紅光和藍光處理。紅光處理下葉片的NPQ顯著高于對照、紅藍混合光和藍光處理，而紅藍混合光和藍光處理下葉片的NPQ雖然顯著高于對照處理，但顯著低于紅光處理。

2.6 不同光質(zhì)對桑樹幼苗葉片抗氧化酶活性與丙二醛含量的影響

SOD、POD、CAT是植物活性氧清除系統(tǒng)的重要組成部分，由圖3可以看出，不同光質(zhì)處理顯著影響了葉片中SOD、POD、CAT的活性(圖3)。紅光、紅藍混合光、藍光處理下葉片的SOD、POD、CAT的活性均顯著高于白光對照處理，且在藍光處理下葉片的SOD、POD、CAT的活性最高。同時，紅光、紅藍混合光、藍光處理下葉片的丙二醛(MDA)含量均顯著低于白光對照。

2.7 不同光質(zhì)對桑樹幼苗葉片橫切面結構的影響

由表4可知，不同光質(zhì)也顯著影響了葉片橫切面的解剖結構(表4)。白光對照處理下葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度均最大，紅藍混合光、藍光處理下葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度次之。紅光處理下葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度最小且顯著小于對照和藍光處理。

表4 不同光質(zhì)對桑樹葉片橫切面解剖結構的影響

Table 4 Effects of different light qualities on anatomical structure of leaf cross sections in mulberry leaves

處理Treatment葉片厚度Leaf thickness(μm)柵欄組織厚度Palisade tissue thickness(μm)海綿組織厚度Spongy tissue thickness(μm)W92.67±1.53a31.17±0.76a36.67±2.08aR75.83±1.89c22.13±1.21d18.03±1.95cRB81.00±1.00b28.53±1.50b19.33±2.08cB90.73±2.05a25.20±1.06c31.07±1.01b

3 討論

松嫩平原鹽堿化土地面積已達320×104hm2，已成為世界三大蘇打鹽堿土集中分布區(qū)之一[22]。因此，如何有效地利用和開發(fā)鹽堿地以減輕土壤鹽堿化對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的危害，成為可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題之一。黑龍江省松嫩平原地區(qū)農(nóng)民通過栽植桑樹，不僅改善了當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，而且促進了蠶業(yè)的發(fā)展。但是如何在冬季農(nóng)閑時期采用設施栽培措施獲得健壯幼苗還需選取適合桑樹幼苗生長的光質(zhì)。本試驗對這一問題進行了初步探究，結果表明，不同光質(zhì)顯著影響了桑樹幼苗的生長、形態(tài)建成，與白光處理的植株相比，紅光處理植株的莖長、葉面積最大，其次是紅藍混合光，藍光下最小。藍光可抑制較多植物物種的節(jié)間生長和細胞分裂[23～25]。結合這些前人結果，本試驗中紅藍混合光和藍光處理下，桑樹幼苗莖長和葉面積變小(圖1)，可能是由于細胞分裂和細胞擴展受抑制所致。Sebastian和Prasad[26]研究發(fā)現(xiàn)生長在單質(zhì)藍光LEDs下的水稻(OryzasativaL.)生物量低于白光LEDs下生長植株，但顯著高于紅光下生長植株。而在一定比例紅藍LEDs光下培養(yǎng)的陸地棉(GossypiumhirsutumL.)組培苗的生物量高于在白色熒光燈下或單質(zhì)紅光LEDs、單質(zhì)藍光LEDs生長的植株[27]。本試驗結果表明，紅藍混合光處理下植株的生物量雖然顯著低于白光對照處理，但高于紅光和藍光處理。Hogewoning等[10]研究發(fā)現(xiàn)單質(zhì)紅光處理下黃瓜幼苗的LMA最低，幼苗的LMA隨著紅藍組合光中藍光比例的增加而變大，但在單質(zhì)藍光下的LMA有所降低。我們的研究結果與此并不完全一致，本研究中，雖然紅光處理下葉片的LMA最低，但藍光下的LMA顯著高于其它光質(zhì)處理。這些結果表明光質(zhì)改變可用于調(diào)控桑樹幼苗的生長和形態(tài)，同時植株對光質(zhì)的響應是物種依賴的。

較高比例的藍光可使植株葉片呈現(xiàn)“陽生型”特征，這些葉片具有高的LMA和光合能力[28～29]。在本研究中，紅藍混合光處理下葉片的Pn高于紅光、藍光處理，且紅藍混合光處理下葉片的Pn與白光對照處理相比無顯著差異。本研究中，藍光處理下葉片的葉綠素含量與白光對照相比無顯著差異，顯然藍光下桑樹葉片較低的Pn與葉綠素含量無關。藍光和紅光都可誘導氣孔張開[30]。本研究中，藍光處理下葉片的Gs顯著高于其它光質(zhì)處理，但Pn顯著低于白光對照處理。因此，CO2的可利用性并不限制藍光處理下植株的光合作用。單質(zhì)光下Pn的降低是由激發(fā)能在光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ間不均衡分配造成的[31]。與此相符合的是，本研究結果表明在紅光、藍光處理下葉片的實際光化學效率(ΦPSⅡ)急劇降低。然而，其它因素可能也造成了紅光下葉片Pn降低。本研究中，紅光處理下葉片的Gs、葉綠素含量、可溶性蛋白含量、葉片單位面積總N含量大幅降低。由于Rubisco是葉片中可溶性蛋白的主要組成部分，所以紅光處理下葉片的Rubisco含量可能顯著下降。同時植株的光合作用也依賴于葉片總N含量[32]。因此除了紅光下葉片的ΦPSⅡ降低，與紅藍混合光、藍光下生長葉片相比，卡爾文循環(huán)中CO2羧化受抑制也是引起紅光下生長葉片Pn降低的原因。而紅藍混合光下生長葉片的Gs、ΦPSⅡ、可溶性蛋白含量、葉綠素含量與白光處理無顯著差異，這可能是紅藍混合光下葉片Pn與白光處理無顯著差異的原因。此研究結果和紅藍組合光下水稻植株的Pn高于紅光處理與紅藍組合光下植株葉片具有較高的Rubisco含量、總N含量有關的報道相符[28]。Hogewoning等[10]則發(fā)現(xiàn)紅藍組合光、藍光處理下植株葉片的Fv/Fm和ΦPSⅡ高于紅光處理，而紅藍組合光處理下植株的Fv/Fm和ΦPSⅡ與藍光下處理無明顯差異，單質(zhì)紅光可引起光合機構功能失調(diào)。本試驗研究結果與這些報道相一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)，與白光對照處理相比，在藍光、紅光處理下葉片的NPQ大幅增加，而紅藍混合光處理下增加幅度較小。這表明，在單質(zhì)紅光、單質(zhì)藍光下桑樹幼苗葉片的光合機構功能失調(diào)導致光系統(tǒng)Ⅱ捕獲的激發(fā)能以非光化學猝滅形式耗散掉的比例增加。

在本研究中，紅光下植株葉片的葉綠素a/b比值顯著低于紅藍混合光、藍光處理。這與光質(zhì)對黃瓜葉片葉綠素a/b比值影響相一致[10]。光質(zhì)在葉綠素的生物合成中起重要作用[33]。前人研究結果表明紅光不利于葉綠素的形成，表現(xiàn)為紅光下葉綠素的生物合成前體5-氨基乙酰丙酸減少[34～35]。而有較多研究表明藍光有利于葉綠素的積累[34～36]。藍光可逆轉紅光誘導的抑制葉綠素合成的響應[35]。因此，在本研究中紅藍混合光、藍光下較高的葉綠素a/b比值可能是由于藍光對葉綠素生物合成的影響造成的。同時，在本研究中白光處理下葉片的淀粉含量明顯低于紅光、紅藍混合光和藍光處理。顯然，本研究中不能排除光合產(chǎn)物積累對紅光、紅藍混合光和藍光處理下桑樹植株光合作用的反饋抑制[10]。

最近的研究表明，與白光處理相比，單質(zhì)紅光、單質(zhì)藍光處理下水稻葉片中的抗氧化酶活性明顯提高，而MDA含量顯著降低[26]。同時，Dong等[37]發(fā)現(xiàn)，與白光處理相比，紅光、紅藍混合光可增強花期小麥葉片的SOD活性。本試驗結果表明，與白光處理相比，紅光、紅藍混合光和藍光處理下葉片的SOD、POD、CAT活性大幅提高。這可能是由于紅光、藍光可被光合色素更有效的吸收，從而造成光合電子傳遞鏈的飽和，最終引起抗氧化活性的增強[38]。較高的SOD、POD、CAT活性可有效的清除ROS，減輕ROS對細胞膜脂的過氧化傷害。所以在本研究中紅光、紅藍混合光和藍光處理下葉片的膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著低于白光處理。

葉片是植物中可塑性較強的器官，植物葉片對環(huán)境條件的變化敏感，光質(zhì)對葉片的解剖結構有較明顯的影響[39]。生長在單質(zhì)藍光和紅藍組合光下陸地棉葉片厚度、柵欄組織厚度均顯著高于單質(zhì)紅光處理，但葉片厚度、柵欄組織厚度與藍光比例并不呈現(xiàn)線性相關關系[27]。本試驗中，相比于紅光處理，紅藍混合光、藍光有利于葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度的增加。這與前人研究結果相一致[27,40]。以上結果表明，補充藍光可削弱單質(zhì)紅光對桑樹幼苗葉片中葉肉組織發(fā)育的不利影響，藍光可能在調(diào)節(jié)桑樹葉片組織發(fā)育中起作用。

綜上所述，本研究表明紅光促進桑樹幼苗莖伸長、葉片展開，降低比葉重、葉片總N含量、Gs。藍光抑制莖伸長和葉片展開，增加比葉重、葉片總N含量和Gs。藍光下Pn的降低主要歸因于光系統(tǒng)功能失調(diào)，而紅光下也受葉綠素含量、可溶性蛋白含量和Gs降低影響。紅藍混合光下植株的生長狀況、生理特征與白光下相似。本試驗研究結果表明一定比例的紅藍混合光可減少單質(zhì)紅光、藍光對桑樹植株生長發(fā)育的不利影響，紅藍混合光LED具有應用于黑龍江省松嫩平原鹽堿土地區(qū)設施栽培桑樹幼苗的潛力。