硒化魔芋葡甘寡糖的合成及其抗氧化活性

劉啟順，陳 瑋，鞏鳳芹,2，譚海東，尹 恒,*

（1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物與糖工程組，遼寧 大連 116023 ；2.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023 ）

魔芋是天南星科磨芋屬多年生草本植物[1]，其在中國和日本等國具有很長的食用歷史。中國早在2 000多年前就開始栽培魔芋，食用歷史悠久，但在20世紀(jì)80年代中期才開始真正的魔芋精粉加工[2]。魔芋主要分布在我國的四川、云南、貴州、陜西等地，此外重慶、湖北、湖南、廣西、江蘇、浙江、甘肅、寧夏、福建等地也有廣泛種植。魔芋富含多糖，其葡甘聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為30%～55%[3]。魔芋葡甘聚糖又稱魔芋多糖，除醫(yī)學(xué)、食品保健外，魔芋多糖在紡織、印染、化妝品、陶瓷、消防、環(huán)保、軍工、石油開采等方面都有廣泛的用途[4]。

魔芋多糖的結(jié)構(gòu)一般認(rèn)為是由β-1,4-吡喃糖苷鍵與β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按物質(zhì)的量比1∶1.6或1∶1.69連接而成，具有部分β-1,3-葡萄糖支鏈，且主鏈上每9～19 個(gè)糖殘基C6位上有一個(gè)乙?；鶊F(tuán)[5]。有學(xué)者認(rèn)為單糖隨機(jī)排列于主鏈上，其他學(xué)者則認(rèn)為單糖組成基本的重復(fù)單元而非隨機(jī)分布[6]。在主鏈甘露糖的C3位上存在通過β-1,3-糖苷鍵連接的支鏈，每32 個(gè)糖殘基上約有3 個(gè)支鏈，占主鏈的8%左右[7]。魔芋葡甘聚糖特殊的結(jié)構(gòu)雖使其具有多種生物學(xué)功能，但是其在水中為膠體，黏度大、溶解度小，使用不便，因此在各種食品中添加量少，限制了其生物活性在食品中的體現(xiàn)。由魔芋多糖降解成的魔芋葡甘寡糖（konjac oligo-glucomannan，KOGM）分子質(zhì)量小、在水中可溶、易于吸收，能克服上述問題。有研究表明，KOGM具有多種生物活性，與魔芋多糖相比，魔芋低聚糖具有優(yōu)良的性能，能夠改善食品品質(zhì)、保鮮食品、改善人體腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖、血脂[8]、腸道解毒、促進(jìn)家畜生長和提高肉料比等[9]。

硒是生命必需的微量元素[10]，具有抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、影響人和動物的生殖發(fā)育、解毒等生物學(xué)功能[11]。硒在體內(nèi)以硒代半胱氨酸的形式構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心，可清除自由基，抑制脂質(zhì)氧化或過氧化，引起過氧化物的廣泛分解或還原，防止細(xì)胞損傷。自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物是損害機(jī)體的最主要途徑之一。某些癌癥、腫瘤、心血管疾病、克山病、大骨節(jié)病和艾滋病等都與體內(nèi)缺硒有關(guān)[12-14]。

因?yàn)槲谌梭w健康中的重要作用，1973年世界衛(wèi)生組織專家委員會正式宣布硒是人體生理必需的微量元素之一，1994年中國衛(wèi)生部將硒列為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑。缺硒是一些疾病的誘因，硒過量則會引發(fā)中毒，而二者之間的安全范圍比較窄。為了使硒更好地發(fā)揮其生理保健作用，確定安全合理的日硒攝入量十分必要，但是目前世界各國推薦的硒攝入量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。美國食品與營養(yǎng)委員會提出，要滿足機(jī)體正常代謝，成人每天攝入硒的安全與適宜范圍推薦量為50～200 μg；中國營養(yǎng)學(xué)會發(fā)布報(bào)告認(rèn)為成人每天適宜的膳食硒攝入量應(yīng)為50～250 μg；此外，加拿大的推薦量為98～224 μg/d，英國的推薦量為70 μg/d，新西蘭的推薦量僅為30 μg/d，芬蘭的推薦量為20～30 μg/d。雖然新西蘭和芬蘭的推薦量較低，但是正常人在該劑量下均無缺硒表現(xiàn)[15]。

一般認(rèn)為正常人攝入超過生理需要量50 倍的硒有中毒的危險(xiǎn)。由于環(huán)境高硒、補(bǔ)硒過量或誤用藥物等原因而攝入過量的硒會引發(fā)急性或慢性硒中毒。硒的中毒劑量在食物中為5 mg/kg，在飲用水為0.5 mg/kg。根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算，如果日硒攝入量在400～800 mg/kg范圍內(nèi)便可能引發(fā)急性中毒，表現(xiàn)為指甲和頭發(fā)脫落，伴隨惡心、嘔吐、疲勞、腹瀉、腹痛、汗液有酸臭味等；嚴(yán)重者表現(xiàn)為支氣管炎、高熱、直立性低血壓、肝腫大，甚至虛脫、呼吸衰竭而死。慢性硒中毒往往是由于長期硒攝入量在2.4～3.0 mg/d而出現(xiàn)的癥狀[16]。

硒元素不能在體內(nèi)自行合成，只能靠外部攝入補(bǔ)充。硒主要以無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種形式存在，與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒毒性低、副作用小、活性更好。有機(jī)硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有無機(jī)硒的多種活性，還具有多糖的各種生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，更利于被機(jī)體吸收利用[17]。天然提取的多糖中硒含量很低，即使從富硒地區(qū)種植的魔芋中提取的多糖含硒量也低于5 mg/kg[18]。

本研究在實(shí)驗(yàn)室制備KOGM的基礎(chǔ)上，建立了硒化KOGM（selenium-containing KOGM，KOGM-Se）的合成技術(shù)（圖1），并對其結(jié)構(gòu)和硒含量進(jìn)行表征，研究其抗氧化活性，以期開發(fā)高硒含量的抗氧化有機(jī)硒食品原料。

圖1 KOGM-Se合成路線示意圖Fig. 1 Synthetic route of KOGM-Se

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KOGM由天然產(chǎn)物與糖工程組實(shí)驗(yàn)室自制，聚合度2～10。制備過程參照文獻(xiàn)[19]：將5.0 mg/mL魔芋葡甘聚糖與葡甘聚糖酶（酶活力65 U/mg）按照體積比9∶1混合，在25 ℃下反應(yīng)2 h；離心后，將上清液冷凍干燥得到KOGM。

亞硒酸鈉、硝酸（均為分析純） 天津大茂化學(xué)試劑廠；氯化鋇（分析純） 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Vector22傅里葉變換紅外光譜儀、AVANCE III 400 MHz核磁共振儀 美國Bruker公司；NexION 300D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 KOGM-Se制備

取0.50 g聚合度2～8的KOGM加入50 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%硝酸溶液中，攪拌溶解；加入0.61 g亞硒酸鈉和0.86 g氯化鋇，攪拌溶解；將上述溶液置于70 ℃反應(yīng)9 h；加入0.50 g硫酸鈉，8 000 r/min離心去除沉淀；上清液用碳酸氫鈉中和至中性；向反應(yīng)液加中入5 倍體積乙醇，產(chǎn)生白色沉淀；抽濾得到固體，用乙醇洗2～3 遍，將濾餅置于真空干燥器中60 ℃干燥2 h，得白色粉末0.4 g。

1.3.2 KOGM-Se結(jié)構(gòu)表征和含量的測定

傅里葉變換紅外光譜表征：取樣品1 mg與99 mg KBr混合壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描。

核磁共振分析：在核磁管中加15～25 mg樣品和0.5 mL D2O，混合溶解，置于核磁共振儀中掃描分析；化學(xué)位移以四甲基硅烷為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。

樣品中硒含量的測定：稱取一定量樣品，加入濃硝酸，在100 ℃的密閉消化罐中消化4 h，以1%超純硝酸稀釋定容，用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定其硒含量。

1.3.3 KOGM-Se體外抗氧化活性分析

1.3.3.1 對羥自由基的清除能力

利用Fenton試劑法[20]檢測KOGM及KOGM-Se對羥自由基的清除作用。將樣品配成1、2、4、6、8、10 mg/mL溶液。將1.0 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1.0 mL待測液混合均勻，加入1.0 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液啟動反應(yīng)，于37 ℃反應(yīng)30 min，在510 nm波長處測定溶液的吸光度。陽性對照組為VC，空白對照組為蒸餾水。按式（1）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度；Ai為樣品組、陽性對照組的吸光度；Aj為1.0 mL水楊酸-乙醇溶液代替1.0 mL硫酸亞鐵溶液作試劑空白的吸光度。

1.3.3.2 對超氧陰離子自由基的清除能力

采用鄰苯三酚法[21]測定KOGM及KOGM-Se對超氧陰離子自由基的清除作用。將樣品配成1、2、4、6、8、10 mg/mL溶液。將5.0 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和0.5 mL寡糖溶液混合均勻，于37 ℃水浴預(yù)熱10 min，加入1.0 mL 3.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，反應(yīng)6 min后迅速加入0.5 mL 8 mmol/L HCl終止反應(yīng)，于420 nm波長處測定吸光度。陽性對照組為VC，空白對照組為蒸餾水。按式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為空白對照組吸光度；Ai為樣品組、陽性對照組吸光度。

1.3.3.3 對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力

采用對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）評價(jià)體系[22]研究KOGM及KOGM-Se對DPPH自由基的清除作用。將2.0 mL樣品溶液（質(zhì)量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg/mL）和2.0 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液混合均勻，于25 ℃反應(yīng)15 min，在517 nm波長處測定吸光度。陽性對照組為VC，空白對照組為蒸餾水。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。式中：Aj為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液代替DPPH溶液作試劑空白的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，計(jì)算平均值，在SEM模式下計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。核磁共振波譜數(shù)據(jù)采用DMFit 2015軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成ASCII格式，采用Origin Pro 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 KOGM-Se結(jié)構(gòu)的表征

圖2 KOGM-Se傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectrum of KOGM-Se

從KOGM-Se的傅里葉變換紅外光譜圖（圖2）可以看出，3 383 cm-1處的強(qiáng)吸收峰為—OH的伸縮振動峰。2 929 cm-1和1 384 cm-1處的吸收峰為C—H的伸縮振動峰和變角振動峰。1 633 cm-1處出現(xiàn)的峰為CHO的C＝O鍵的伸縮振動峰。1 060～1 027 cm-1處是糖殘基C—O—C和C—O—H鍵的伸縮振動峰。在740 cm-1處有明顯的吸收峰，為亞硒酸酯特征吸收峰，說明KOGM上發(fā)生了硒化反應(yīng)，且硒的存在形式為亞硒酸酯[23]。

圖3 KOGM-Se和KOGM的核磁共振氫譜圖Fig. 3 1H nuclear magnetic resonance spectra of KOGM-Se and KOGM

比較K O G M-S e和K O G M的核磁共振氫譜（圖3），可以看出兩者峰整體形態(tài)沒有太大變化；δ 4.5處的峰為β-糖苷鍵的C1上H峰；由于化合物為寡糖，δ 3.3～δ 4.2處的峰為糖殘基C2～C5上的H峰，但沒有完全分開；δ 2.1處的峰為乙?；螩—H的H峰[24]。KOGM-Se糖殘基在δ 2.1處峰明顯減弱，說明糖殘基的修飾基團(tuán)乙?；急葴p少。

圖4 KOGM-Se和KOGM的核磁共振碳譜圖Fig. 4 13C nuclear magnetic resonance spectra of KOGM-Se and KOGM

比較KOGM-Se和KOGM的核磁共振碳譜（圖4），可以看出兩者峰整體形態(tài)沒有大的變化。δ 103處的峰為β-葡萄糖苷鍵C1的峰，δ 101處的峰為β-甘露糖苷鍵C1的峰；δ 71～δ 79處的峰為糖殘基C2～C5的峰；δ 61左右的峰為C6的峰[24]。從圖4中可以看出，兩種寡糖在δ 101處的峰均高于δ 103處，說明甘露糖含量高于葡萄糖含量，這與KOGM的單糖組成中甘露糖與葡萄糖含量的比例是一致的。C2～C5的峰變化不大，δ 61左右C6的峰位移增加δ 0.1，說明亞硒酸酯化反應(yīng)發(fā)生在C6位。另外，與KOGM相比，KOGM-Se在δ 175處的乙?；迕黠@減弱，也說明乙酰基比例減少。綜合傅里葉變換紅外光譜和核磁共振的表征結(jié)果，說明KOGM經(jīng)硒化修飾后，得到的產(chǎn)物為KOGM亞硒酸酯。

經(jīng)電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測分析，KOGM-Se中硒的含量為5.9 g/kg，KOGM中未檢測到硒。據(jù)報(bào)道，天然富硒土壤種植魔芋的葡甘聚糖硒含量最高為0.23 mg/kg，其制成的魔芋精粉硒含量為5 mg/kg[18]。本研究合成的KOGM-Se中硒的含量遠(yuǎn)高于天然多糖，且分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于多糖，更利于人體吸收和利用，可作為理想的有機(jī)硒食品原料。

2.2 KOGM-Se的抗氧化活性分析

圖5 KOGM-Se和KOGM對羥自由基的清除作用Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging activity of KOGM-Se and KOGM

圖6 KOGM-Se和KOGM對超氧陰離子自由基的清除作用Fig. 6 Superoxide radical-scavenging activity of KOGM-Se and KOGM

清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力可較好地表征化合物的體外抗氧化活性。從圖5～7可以看出，兩種寡糖對超氧陰離子自由基沒有表現(xiàn)出清除活性；KOGM在高質(zhì)量濃度時(shí)對DPPH自由基有一定的清除活性，而KOGM-Se沒有表現(xiàn)出清除活性。硒化后的KOGM對羥自由基表現(xiàn)出很好的清除活性，其清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，最高超過90%，而未硒化的KOGM沒有表現(xiàn)出清除活性。糖類化合物硒化反應(yīng)后，會帶來理化性質(zhì)和立體構(gòu)象的變化，導(dǎo)致其活性的變化，某些活性指標(biāo)水平提高，而有些指標(biāo)卻不如未硒化的多糖[25]。

圖7 KOGM-Se和KOGM對DPPH自由基的清除作用Fig. 7 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity of KOGM-Se and KOGM

硒多糖具有清除自由基的能力，可以保護(hù)細(xì)胞敏感分子，提高機(jī)體抗氧化的能力[26]。高玉杰等[27]合成的滸苔硒多糖與滸苔多糖相比DPPH自由基的清除能力明顯增強(qiáng)，且在1.0～10.0 mg/mL范圍內(nèi)具有一定的還原力。李華為等[28]研究了富硒蛹蟲草硒多糖的抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硒多糖清除羥自由基的能力優(yōu)于過氧化氫酶，且二者共存時(shí)對羥自由基的清除具有協(xié)同作用。王曉梅等[29]合成的硒化壇紫菜多糖具有清除超氧陰離子自由基和羥自由基的活性，且有一定的還原能力。宋逍等[30]研究了硒化款冬花多糖清除超氧陰離子自由基、羥自由基以及DPPH自由基的能力，發(fā)現(xiàn)硒多糖在5 mg/mL時(shí)清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于VC，而清除超氧陰離子自由基、羥自由基的能力不如VC，但其清除能力都優(yōu)于多糖，顯示出了很強(qiáng)的抗氧化能力。商龍臣等[31]合成了硒化南瓜多糖，發(fā)現(xiàn)其對超氧陰離子自由基表現(xiàn)出很好的清除作用，但是對羥自由基的清除活性很低。上述研究的對象均為天然多糖和硒多糖，其所表現(xiàn)出的抗氧化活性規(guī)律與本研究的結(jié)果有所不同。

有機(jī)硒不僅在體外表現(xiàn)出抗氧化活性，在體內(nèi)也具有很好的生物活性。研究表明硒多糖能有效提高血液中硒含量和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，顯著降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，增加紅細(xì)胞抗過氧化氫氧化損傷的能力[32]。Sheng Yu等[33]從桔?；糠蛛x得到硒多糖，研究了其對過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)用硒多糖預(yù)處理可減少過氧化氫損傷后PC12細(xì)胞存活率的降低，阻止膜損傷，減弱細(xì)胞內(nèi)活性氧的形成，表明硒多糖可通過抑制氧化應(yīng)激來減少神經(jīng)元氧化損傷。Liu Min等[34]研究了菌絲體硒多糖在體內(nèi)的抗氧化和抗炎作用，發(fā)現(xiàn)菌絲體硒多糖具有明顯抗氧化作用，其通過調(diào)控相關(guān)炎癥反應(yīng)顯著改善了肺損傷，表明菌絲體硒多糖可能是治療肺損傷及其并發(fā)癥的潛在有效候選藥物。Yuan Bo等[35]采用微波輔助法合成了硒化甜土豆多糖，發(fā)現(xiàn)其在體外有較好的抗氧活性和還原力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其可有效抑制腫瘤生長（抑制率超過50%），并調(diào)節(jié)小鼠的免疫因子（白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子-α和血管內(nèi)皮生長因子）水平。硒化甜土豆多糖可顯著降低糖尿病大鼠體內(nèi)丙二醛含量，顯著增加器官中酶抗氧化劑活性和非酶抗氧化劑水平。Lian Kexun等[36]合成了硒化甘草多糖，發(fā)現(xiàn)其體外抗氧化活性一般，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的抗氧化活性，能夠顯著提高血液和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，顯著降低腎臟和肝臟中丙二醛的含量。

從上述研究可以看出，目前關(guān)于硒化糖的研究主要為硒多糖方面，關(guān)于寡糖的硒化和活性研究較少。本研究合成的KOGM-Se在體外表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，且分子質(zhì)量比多糖小很多，更利于體內(nèi)的吸收和利用，推測在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中會表現(xiàn)出更好的抗氧化活性。后續(xù)將進(jìn)一步開展KOGM-Se在體內(nèi)的生物活性實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié) 論

本研究建立了KOGM-Se合成工藝，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，對硒含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，制備的KOGM-Se為KOGM亞硒酸酯，硒化位置可能為C6位。KOGM-Se中硒的含量為5.9 g/kg，遠(yuǎn)高于富硒土壤種植魔芋提取的天然多糖（0.23 mg/kg）。KOGM-Se作為一種高硒含量有機(jī)硒化物具有較好的抗氧化活性，可作為理想的有機(jī)硒食品原料。