苦蕎茶多糖誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制

楊二萬(wàn)，張 敏，楊興斌，楊紅燕,*

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710032 ；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119 ）

苦蕎（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn）種子經(jīng)過(guò)篩選、烘烤等工序可制成苦蕎茶，因其具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等眾多生物學(xué)功能，被認(rèn)為是一種“健康飲品”而備受歡迎[1-4]?？嗍w茶多糖（tartary buckwheat tea polysaccharide，TBTP）是苦蕎茶最主要的活性成分之一，本課題組利用水提醇沉法結(jié)合超聲輔助技術(shù)，使TBTP提取率由3%提高至8%左右，為苦蕎茶活性物質(zhì)研究及應(yīng)用、推廣提供了一定的理論依據(jù)[5-6]。研究表明，苦蕎多糖能夠呈劑量依賴性地明顯清除羥自由基，具有良好的抗氧化活性，使人肝癌細(xì)胞染色質(zhì)DNA斷裂、細(xì)胞核形態(tài)聚縮，抑制肝癌細(xì)胞增殖[7]。Wu等的研究發(fā)現(xiàn)蕎麥多糖可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化并抑制其增殖[8]。苦蕎茶和苦蕎在生物活性上有諸多相似之處，而前者作為一種更加便捷的食品，在生活中具有更好的推廣和應(yīng)用前景。然而，TBTP對(duì)腫瘤的影響及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以超聲波輔助提取的TBTP為原材料，對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察細(xì)胞增殖、凋亡情況以及氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)，探討TBTP對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響并探索其機(jī)制，以期為苦蕎茶保健食品的開(kāi)發(fā)及產(chǎn)品推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎茶購(gòu)自四川西昌市滋元食品有限公司。TBTP采用超聲波技術(shù)輔助水提醇沉獲得，主要包括D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等，其相對(duì)含量依次為4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%和13.64%[7]。A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

RPMI-1640、胎牛血清 美國(guó)Hyclone公司；DHE上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Sigma公司；Mito SOX熒光染料 美國(guó)Thermo Fisher公司；Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞色素c、剪切型半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、細(xì)胞色素c氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV，COX IV）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶一抗 美國(guó)Abcam公司；線粒體分離試劑盒 美國(guó)Biovision公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG Labtech公司；GUAVA easy Cyte TM8HT流式細(xì)胞儀 美國(guó)Millipore公司；凝膠電泳系統(tǒng)、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；LSM800型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

A549細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，分為空白對(duì)照組和50、100、200、400、800 μg/mL TBTP處理組，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

用上述不同質(zhì)量濃度TBTP分別處理A549細(xì)胞12、24、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT反應(yīng)4 h，棄去培養(yǎng)液后加入150 μL二甲基亞砜，于37 ℃搖床充分振搖0.5 h，在多功能酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各處理組的OD值。細(xì)胞增殖率以各處理組與空白對(duì)照組OD值之比表示。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞處理結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 遍，使用100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC染液充分混勻，再加入5 μL碘化丙啶在室溫、避光條件下染色15 min。染色結(jié)束后輕輕混勻細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC和PI雙染之后，流式細(xì)胞圖被分成4 個(gè)象限：第一象限為晚期凋亡細(xì)胞；第二象限為壞死細(xì)胞；第三象限為未發(fā)生凋亡的細(xì)胞；第四象限為早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率＝晚期細(xì)胞凋亡率+早期細(xì)胞凋亡率，即第一和第四象限百分率之和。

1.3.4 細(xì)胞ROS水平檢測(cè)

采用DHE染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。接種于共聚焦培養(yǎng)皿中的A549細(xì)胞經(jīng)TBTP處理結(jié)束后，使用0.5 μmol/L DHE染液在37 ℃孵箱中染色30 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培養(yǎng)基后在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光信號(hào)。DHE紅色相對(duì)熒光強(qiáng)度增加表示ROS水平增加。

1.3.5 細(xì)胞線粒體ROS水平檢測(cè)

采用Mito SOX熒光染料檢測(cè)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平。接種于共聚焦培養(yǎng)皿中的A549細(xì)胞經(jīng)TBTP處理結(jié)束后，使用5 μmol/L Mito SOX染液于37 ℃培養(yǎng)箱染色10 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培養(yǎng)基后在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光信號(hào)。Mito SOX紅色相對(duì)熒光強(qiáng)度增加表示線粒體ROS水平增加。

1.3.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

A549細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，TBTP處理結(jié)束后加入10 μg/mL JC-1染液，于37 ℃下孵育15 min，用PBS清洗3 遍后加入1 mL完全培養(yǎng)基，在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光信號(hào)。當(dāng)線粒體膜電位低時(shí)，JC-1產(chǎn)生綠色熒光；當(dāng)線粒體膜電位高時(shí)，JC-1產(chǎn)生紅色熒光，以紅/綠相對(duì)熒光強(qiáng)度比來(lái)反映線粒體膜電位的變化。

1.3.7 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞處理結(jié)束后，用預(yù)冷PBS清洗3 次，加入含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，留取細(xì)胞上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，調(diào)至統(tǒng)一質(zhì)量濃度后100 ℃煮10 min使蛋白變性。進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入相應(yīng)一抗（體積比為1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗（體積比為1∶5 000）室溫孵育2 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光、采集圖像，以目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參（分別為β-actin和COX IV）條帶相對(duì)灰度的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TBTP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖1 TBTP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effect of TBTP on A549 cell proliferation

如圖1所示，TBTP能夠以時(shí)間和劑量依賴性的方式抑制A549細(xì)胞的增殖。TBTP處理A549細(xì)胞12、24、48 h時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖率顯著減低（P＜0.05），提示TBTP與A549細(xì)胞增殖率間存在劑量依賴關(guān)系。同時(shí)，相同質(zhì)量濃度TBTP處理A549細(xì)胞時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），提示TBTP與A549細(xì)胞增殖率間存在時(shí)間依賴關(guān)系。100、200、400 μg/mL TBTP處理A549細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，且細(xì)胞狀態(tài)尚可完成實(shí)驗(yàn)，因此進(jìn)一步的機(jī)制研究應(yīng)用上述條件處理。

2.2 TBTP對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

圖2 TBTP對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of TBTP on A549 cell apoptosis

如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05）。同時(shí)，隨著TBTP質(zhì)量濃度的增加，A549細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了TBTP與細(xì)胞凋亡率的劑量依賴關(guān)系。

2.3 TBTP對(duì)A549細(xì)胞以及線粒體內(nèi)ROS釋放的影響

圖3 TBTP對(duì)A549細(xì)胞以及線粒體內(nèi)ROS水平的影響Fig. 3 Effect of TBTP on ROS level in mitochondria and A549 cells

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組A549細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度均顯著增加（P＜0.05），提示TBTP促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；隨著TBTP質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度也顯著增加（P＜0.05）。Mito SOX熒光染料檢測(cè)線粒體ROS水平結(jié)果與DHE染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果顯示出一致的趨勢(shì)，即TBTP能夠呈濃度依賴性地顯著增加線粒體ROS的生成（P＜0.05）。

2.4 TBTP對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖4 TBTP對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig. 4 Effect of TBTP on mitochondrial membrane potential of A549 cell

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組細(xì)胞紅/綠相對(duì)熒光強(qiáng)度比均顯著降低（P＜0.05），提示TBTP具有降低細(xì)胞線粒體膜電位的作用。隨著TBTP質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05）。

2.5 TBTP對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 TBTP對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Expression of apoptosis-related proteins in A549 cells after TBTP treatment

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組細(xì)胞Bcl-2蛋白及線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c表達(dá)顯著降低，而B(niǎo)ax和剪切型Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），提示TBTP能夠顯著降低Bcl-2/Bax，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素c釋放及剪切型Caspase-3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨著TBTP質(zhì)量濃度的增加，Bcl-2/Bax比和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c水平顯著降低，而剪切型Caspase-3表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

3 討 論

流行病學(xué)資料顯示，肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位[9]。80%以上的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌，70%左右的患者就診時(shí)已屬腫瘤晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此化療成為非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段之一[10]。然而，化療的毒副作用使得部分肺癌患者不能耐受，嚴(yán)重影響患者生存和生活質(zhì)量。植物多糖為天然的大分子生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗衰老等多種生物學(xué)效應(yīng)。相較于化學(xué)合成藥物，從天然植物分離獲得的植物多糖毒副作用更小且作用機(jī)制廣泛，同時(shí)，生產(chǎn)工藝的改進(jìn)為植物多糖的提取提供了依據(jù)，因此植物多糖具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[11-14]。TBTP是苦蕎茶中發(fā)揮保健功能和具有臨床用途的主要活性物質(zhì)，但它對(duì)肺癌細(xì)胞的影響及機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，TBTP處理能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TBTP在50～800 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡呈現(xiàn)良好的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。進(jìn)一步的機(jī)制研究結(jié)果顯示，TBTP處理顯著促進(jìn)了A549細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS的生成，降低線粒體膜電位水平，提示它可能通過(guò)增加細(xì)胞的氧化損傷發(fā)揮抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。此外，TBTP還呈劑量依賴性地抑制Bcl-2/Bax比，促使細(xì)胞色素c從線粒體內(nèi)外流至細(xì)胞質(zhì)，提高細(xì)胞內(nèi)剪切型Caspase-3的水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

苦蕎具有廣泛的生物學(xué)活性。賈喬瑾等發(fā)現(xiàn)從苦蕎中提取出的苦蕎凝集素能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白合成、調(diào)控細(xì)胞microRNA水平，因此可以劑量依賴性地抑制3 種結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[15]。郭曉娜等的研究表明，苦蕎蛋白TBWSP31能夠調(diào)控乳腺癌Bcap細(xì)胞周期，上調(diào)抑癌基因Fas的表達(dá)，發(fā)揮抗乳腺癌的作用[16]。同時(shí)，苦蕎種子、殼及莖葉中黃酮、多酚、蛋白等多種成分都對(duì)細(xì)胞氧化損傷有明確的調(diào)控作用[17]。本研究證實(shí)了苦蕎茶主要成分TBTP促進(jìn)A549細(xì)胞ROS生成及細(xì)胞凋亡的作用，與先前的苦蕎抗腫瘤效應(yīng)研究基本一致，且豐富了苦蕎的藥理學(xué)作用。細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要方式之一，而線粒體是調(diào)控該過(guò)程最重要的細(xì)胞器[18-24]。線粒體為細(xì)胞供能的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生ROS，后者成為細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)信號(hào)分子之一。ROS可直接引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，降低線粒體膜電位，一方面影響細(xì)胞能量代謝，另一方面致使線粒體內(nèi)的凋亡啟動(dòng)因子細(xì)胞色素c釋放入胞質(zhì)，激活Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑[24-25]。Bcl-2家族分子亦參與線粒體形態(tài)和功能的調(diào)控。研究表明，Bcl-2家族分子，尤其是Bax/Bcl-2同源拮抗劑激活可以促進(jìn)線粒體分裂蛋白1定位于線粒體外膜，促進(jìn)線粒體片段化；也可以通過(guò)改變Bcl-2/Bax比調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[26-30]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TBTP可能通過(guò)調(diào)控線粒體ROS生成直接誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；同時(shí)，通過(guò)影響B(tài)cl-2/Bax比調(diào)節(jié)線粒體功能，間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，TBTP能夠增加ROS的生成、降低線粒體膜電位，有效抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為苦蕎茶的抗腫瘤效應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)參考，也為該化合物的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。然而，本研究為A549細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，TBTP抗肺癌作用及機(jī)制還需進(jìn)一步的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)論證和研究。