發(fā)酵麩皮多糖對大鼠空腸組織抗氧化能力、形態(tài)結構和緊密連接蛋白表達的影響

王 園，楊可心，段元霄，王文文，安曉萍，齊景偉*

（內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018 ）

小麥麩皮是小麥加工面粉的副產物，是小麥提取胚芽和胚乳后的剩余部分，主要由小麥的皮層和糊粉層組成[1]。除含有一定量的淀粉、蛋白質、脂肪外，麩皮主要含有質量分數46%左右的非淀粉多糖[2-3]，包括果膠多糖、纖維素多糖以及由阿拉伯木聚糖、混合鏈β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等組成的非纖維素多糖[4]。大量研究表明，麩皮非淀粉多糖中的非纖維多糖具有諸多生物活性，包括抑菌[5]、抗氧化[6-8]、免疫調節(jié)[9-11]和益生作用[12-14]等，故又將此類多糖稱為麩皮活性多糖。

消化道是動物體內營養(yǎng)素消化、吸收和代謝的主要器官。機體代謝過程中產生的過量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）極易誘發(fā)消化道疾病，造成腺體分泌異常、腸道損傷及腸黏膜通透性升高，直接影響機體健康[15]。前期研究已利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌固態(tài)發(fā)酵了小麥麩皮，發(fā)現發(fā)酵麩皮多糖含量可達151.57 mg/g，且其具有一定的抗炎活性[16-17]和抗氧化活性[18]，但關于發(fā)酵麩皮多糖對腸道健康的研究鮮見報道。因此，本實驗以斷奶Wistar大鼠為動物模型，研究發(fā)酵麩皮多糖對大鼠空腸組織抗氧化能力、形態(tài)結構和緊密連接蛋白表達的影響，旨在探討發(fā)酵麩皮多糖保護動物腸道健康的作用效果，為發(fā)酵麩皮多糖的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級斷奶Wistar大鼠，平均體質量（54.42±9.19）g，購自內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（蒙）2015-0001；使用許可證號為SYXK（蒙）2015-0001。

釀酒酵母CGMCC 2.119以及枯草芽孢桿菌CGMCC 1.0892保存于動物科學學院水產實驗室。麩皮、豆粕粉和玉米粉均購于當地市場。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

總抗氧化能力（total antioxitant capacity，T-AOC）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力測試盒及谷胱甘肽（glutathione，GSH）、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy deoxyguanosine，8-OHdG）含量測試盒 武漢基因美生物科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒、TRIzol試劑 美國Thermo Fisher公司；FastQant RT Kit（含gDNase）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ超凈工作臺 上海新苗醫(yī)療器械；GX2型智力光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；SH2-82旋轉氣浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭中旺實驗儀器廠；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械有限公司；微孔板分光光度計 美國Bio-Rad公司；電泳儀、電泳槽 北京六一生物科技有限公司；LC480實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵麩皮多糖的制備

將保藏的釀酒酵母和枯草芽孢桿菌分別接種于滅菌（121 ℃，0.1 MPa）的麥芽汁培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h（37 ℃，120 r/min），使菌體濃度達到108CFU/mL，以體積比6.73∶3.26組成復合菌種液。發(fā)酵底物為麩皮80.46%（質量分數，下同）、豆粕粉9.32%和玉米粉10.22%，總接種量10.4%，料液比為1∶1.16，置于35.4 ℃發(fā)酵52.7 h[15-16]。發(fā)酵結束后，于45 ℃烘箱中烘干（24 h）后粉碎。取干燥后發(fā)酵麩皮10 g，加入200 mL蒸餾水，80 ℃水浴提取30 min，離心（5 000 r/min，15 min）取上清液，上清液加入4 倍體積的體積分數95%乙醇溶液，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀冷凍干燥后為發(fā)酵麩皮多糖[17]。

1.3.2 實驗設計

40 只雄性斷奶Wistar大鼠經過一周的適應期，隨機分為5 組。對照組每天灌服生理鹽水，低、中、高劑量組每天分別灌服20、40、80 mg/kg mb發(fā)酵麩皮多糖；VC組每天灌服100 mg/kgmbVC。實驗為期21 d，在內蒙古農業(yè)大學動物科學學院進行，常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食、飲水。

1.3.3 樣品采集

實驗結束當天，乙醚致暈大鼠。按照解剖學方法，采集空腸組織，生理鹽水洗凈，一段放入質量分數4%多聚甲醛溶液固定，用于腸道形態(tài)結構的測定；一段放入液氮速凍，貯于-80 ℃冰箱待測。

1.3.4 樣品分析

1.3.4.1 抗氧化指標測定

取適量空腸組織，加磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）制備質量分數10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液用于抗氧化相關指標測定。T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活力以及GSH、8-OHdG含量采用試劑盒測定，所有操作均按說明書進行。

1.3.4.2 腸絨毛的形態(tài)觀察和測量

取質量分數4%多聚甲醛溶液固定24 h后的空腸組織，修整后梯度乙醇脫水，經二甲苯至透明，石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片[19]。每個樣品隨機選取10 個完整的絨毛和隱窩進行測量。ZEN顯微圖像分析軟件對空腸絨毛高度（絨毛頂端至隱窩開口處的垂直距離）和隱窩深度（隱窩開口至隱窩基底部的垂直距離）作定量分析，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.3.4.3 mRNA表達水平的檢測

采用TRIzol法提取空腸組織總RNA。經微孔板分光光度計測得A260nm和A280nm比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳法評價RNA純度。參照FastQant RT Kit（with gDNase）說明書分別將各樣品的總RNA進行逆轉錄合成cDNA，并以此為模板，使用表1所列的引物，按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）說明書進行qPCR檢測。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，Claudin-1、Occludin和ZO-1的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。引物采用Primer 5.0軟件設計，由上海生工生物有限公司合成。

表1 qPCR引物信息Table 1 Information about the primers used for qPCR

1.4 數據統(tǒng)計分析

實驗數據采用SAS 8.2軟件對各實驗組進行單因素方差分析，考察灌胃發(fā)酵麩皮多糖和VC是否對大鼠空腸組織抗氧化能力、形態(tài)結構和緊密連接蛋白表達有影響，若方差分析差異顯著則進行鄧肯氏多重比較。同時采用GLM程序利用灌胃發(fā)酵麩皮多糖劑量（20、40、80 mg/kgmb）對檢測指標進行線性和二次回歸分析。統(tǒng)計結果用平均值±標準差表示。P＜0.05為差異顯著，0.05≤P＜0.10為有趨勢，P≥0.10為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵麩皮多糖灌胃對大鼠空腸組織抗氧化指標的影響

表2 發(fā)酵麩皮多糖對大鼠空腸組織抗氧化指標的影響Table 2 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on antioxidant indexes in rat jejunum

由表2可知，空腸組織中T-AOC、CAT活力和GSH含量隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量的增加而增加（線性，P＜0.01；線性，P＜0.01；線性，P＝0.03）；SOD活力隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量呈二次變化（P＜0.01），發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量為40 mg/kgmb時達到最高；GSH-Px活力隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量呈二次變化趨勢（P＝0.06），發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量為40 mg/kgmb時達到最高；8-OHdG含量同樣隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量呈二次變化（P＜0.01），在40 mg/kgmb發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量時達到最低。與對照組相比，灌胃100 mg/kgmbVC顯著提高大鼠空腸組織中T-AOC以及CAT和SOD活力（P＜0.05），顯著降低空腸組織中GSH和8-OHdG含量（P＜0.05）。

2.2 發(fā)酵麩皮多糖灌胃對大鼠空腸形態(tài)結構的影響

表3 發(fā)酵麩皮多糖對大鼠空腸形態(tài)結構的影響Table 3 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on jejunal morphology in rats

圖1 發(fā)酵麩皮多糖對大鼠空腸形態(tài)結構的影響（100×）Fig. 1 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on jejunal morphology in rats (100 ×)

由表3、圖1可知，大鼠空腸絨毛高度隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量升高呈二次變化（P＝0.02），發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量為40 mg/kg mb時達到最高；大鼠空腸隱窩深度呈隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量的增加而降低的趨勢（線性，P＝0.08）；大鼠空腸絨毛高度/隱窩深度呈隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量的增加而升高的趨勢（線性，P＝0.08）。與對照組相比，灌胃100 mg/kg mbVC具有降低大鼠空腸隱窩深度的趨勢（P＝0.07）。

2.3 發(fā)酵麩皮多糖灌胃對大鼠空腸緊密連接蛋白表達的影響

圖2 發(fā)酵麩皮多糖對大鼠空腸緊密連接蛋白表達的影響Fig. 2 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on mRNA expression of tight junction proteins in rat jejunum

由圖2可見，大鼠空腸組織中Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達量隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量呈先升高后降低的趨勢二次變化，均在發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量為40 mg/kg mb時達到最高。與對照組相比，灌胃100 mg/kg mbVC組大鼠空腸組織中Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達量無顯著差異（P≥0.10）。

3 討 論

消化道是動物體內物質代謝和能量代謝非常旺盛的系統(tǒng)，是最大的內分泌和免疫器官。在代謝過程中會產生大量的ROS，如超氧陰離子自由基、羥自由基和H2O2。在正常生理狀態(tài)下，體內ROS的產生與清除處于平衡狀態(tài)。但在遭受各種有害刺激或誘導時，氧化還原動態(tài)平衡被破壞，ROS代謝發(fā)生紊亂，產生氧化應激[20]，造成腺體分泌異常、黏膜組織損傷及通透性升高[15]。

體內存在著由酶促與非酶促組成的防御體系以抵抗氧化應激對機體造成的損傷，酶促防御體系主要由CAT、SOD、GSH-Px等抗氧化酶構成，非酶促防御體系中主要為GSH、維生素等[21]。8-OHdG是由自由基氧化DNA鏈中的鳥嘌呤8位碳原子而產生，8-OHdG只能通過DNA氧化損傷產生，在體內穩(wěn)定存在且不易代謝，是目前國際上公認的評價DNA氧化損傷和氧化應激狀態(tài)的敏感指標。本實驗結果顯示，灌胃一定量的發(fā)酵麩皮多糖可顯著提高大鼠空腸中的T-AOC和CAT、SOD、GSH-Px活力以及GSH含量，顯著降低DNA氧化損傷產物8-OHdG的含量，灌胃40 mg/kg mb發(fā)酵麩皮多糖效果較好。這表明發(fā)酵麩皮多糖可以通過提高抗氧化酶活力和抗氧化物質含量，減少腸道組織內自由基的積累，減輕腸道組織氧化損傷。與之相似，目前已發(fā)現具有抗氧化功能的天然產物能夠提高腸道組織抗氧化能力。段元霄等[22]報道，灌胃麥麩阿魏酰低聚糖可通過提高大鼠回腸組織抗氧化酶活力和谷胱甘肽含量，降低8-OHdG的含量，有效緩解由敵草快誘導的氧化應激。毛湘冰等[23]研究發(fā)現，飼糧中添加84 mg/kg香菇多糖能夠提高斷奶大鼠空腸組織總抗氧化能力，降低丙二醛含量。

腸道黏膜形態(tài)結構（包括腸道絨毛高度和隱窩深度）作為腸道物理屏障功能的重要組成部分，與營養(yǎng)物質的消化吸收密切相關[24]。腸絨毛是小腸上皮和固有層向腸腔隆起形成的許多細小指狀突起，腸絨毛的高度和完整性決定了腸道吸收面積，影響營養(yǎng)物質吸收及動物的生長發(fā)育[25]。腸隱窩是指小腸絨毛根部上皮陷至固有層形成的管狀腺，隱窩深度反映上皮細胞從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細胞，維持正常結構的速度[26]。絨毛高度/隱窩深度可綜合反映腸道功能狀況，比值下降表示腸道黏膜受損，消化吸收功能降低[27]。本實驗結果顯示，灌胃40 mg/kg mb發(fā)酵麩皮多糖提高斷奶大鼠空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，降低隱窩深度。表明發(fā)酵麩皮多糖能夠改善空腸形態(tài)，促進腸道的消化吸收功能。毛湘冰[23]和江昌盛[28]等研究發(fā)現，香菇多糖能夠提高斷奶大鼠空腸絨毛高度和降低隱窩深度，表現出改善空腸形態(tài)結構的作用，結果與本研究結果一致。

緊密連接結構是腸道上皮細胞選擇通透性的決定性因素，Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白是緊密連接結構和功能單位中最為基礎和重要的組成[29]。Occludin蛋白是第一個被確認的緊密連接特異性跨膜蛋白，功能涉及細胞間黏附、移動及通透性。Claudins蛋白是含4 個疏水跨膜區(qū)域的跨膜蛋白，對同型和（或）異型緊密連接蛋白-蛋白相互作用和離子選擇型通道的形成具有決定性的作用。ZO-1蛋白則與維持和調節(jié)上皮柵欄和屏障功能有關[30]。江昌盛等[28]在斷奶大鼠飲水中添加香菇多糖可促進空腸組織Occludin蛋白的表達。與之相似，本實驗發(fā)現，斷奶大鼠空腸組織中Claudin-1、Occludin和ZO-1 3 種緊密連接蛋白的mRNA表達量隨發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量呈二次變化，均在發(fā)酵麩皮多糖灌胃劑量為40 mg/kg mb時達到最高。與空腸結構形態(tài)結果相一致，表明發(fā)酵麩皮多糖提高了腸道的屏障功能。

在本實驗中，斷奶大鼠經40 mg/kg mb發(fā)酵麩皮多糖灌胃處理21 d后，提高空腸組織T-AOC和CAT、SOD、GSH-Px活力以及GSH含量，降低DNA氧化損傷產物8-OHdG的含量；提高空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，降低隱窩深度；提高Claudin-1、Occludin和ZO-1 3 種緊密連接蛋白的mRNA表達量。因此，發(fā)酵麩皮多糖可以改善斷奶大鼠空腸抗氧化能力和形態(tài)結構，提高緊密連接蛋白的表達，起到保護腸道健康的作用。