譚宏亮 陳 凱 習(xí)丙文 秦 婷 潘良坤 謝 駿

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214081)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種在淡水生態(tài)環(huán)境中廣布的革蘭氏陰性菌, 普遍存在于自然界水體、土壤和水生動(dòng)物體表及消化道內(nèi)[1],在特定條件下可引起水生動(dòng)物局部或全身感染, 尤其在漁業(yè)生產(chǎn)中每年都會(huì)造成養(yǎng)殖鯉(Cyprinus carpio)、鯽(Carassius auratus)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietalurus punetaus)和羅非魚(Oreochromisspp.)等養(yǎng)殖品種暴發(fā)出血性敗血病, 是淡水養(yǎng)殖中影響較大的條件性致病菌[2,3]。基于大量病原生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的菌毛(Pilus)、外膜蛋白(Outer membrane protein, OMP)、溶血素(Hemolysin)、氣溶素(Aerolysin)、生物膜(Biofilm)等在病原菌株的黏附、入侵、定植、毒素分泌、宿主營(yíng)養(yǎng)奪取和增殖等致病過程中發(fā)揮重要作用[4—7]。同時(shí), 病原菌能通過群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同細(xì)胞群體生長(zhǎng)、毒力和抗逆性等[8,9]。當(dāng)前, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素、化學(xué)藥物、疫苗和微生物制劑等被廣泛應(yīng)用于防控嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌出血病; 然而,抗生素仍然是最主要的防控手段。隨著病原菌耐藥性、水環(huán)境污染和食品安全等問題日益受到國(guó)家和公眾的廣泛關(guān)注, 水產(chǎn)細(xì)菌病防控迫切需要探索研發(fā)新的防治策略和藥物。

中草藥應(yīng)用于臨床防控人、畜和水生動(dòng)物疾病已有幾千年的歷史。近年, 中草藥藥理學(xué)研究快速推動(dòng)中草藥資源的開發(fā)和利用。藥用植物提取物中的多糖、生物堿、酸、萜類、皂苷和黃酮類等具有重要的殺蟲、抑菌、抗炎和抗氧化等作用。白藜蘆醇(Resveratrol, Res)是一種天然單體化合物, 存在于藥用植物大黃(Rheum palmatum)、虎杖(Reynoutria japonica)和藜蘆(Veratrum nigrum)等,具有抗菌、抗炎和抗氧化等功效[10—12], 能夠抑制細(xì)菌病原泳動(dòng)、群體感應(yīng)、生物膜形成、鞭毛基因表達(dá)和溶血活性[12—17]等。

本研究通過體外試驗(yàn)分析白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)和毒力相關(guān)基因表達(dá)的影響, 并通過人工感染試驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)感染嗜水氣單胞菌異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的保護(hù)作用和對(duì)魚體炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所使用的嗜水氣單胞菌株NJ-35由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉永杰教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。菌株保存在-80℃甘油管中, 使用前在NB平板劃線, 28℃過夜培養(yǎng), 挑取單克隆。

1.2 藥品和試劑

白藜蘆醇(99%)購自aladdin、二甲基亞砜(DMSO)購自碧云天公司、NB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司、無菌脫纖維綿羊血購自南京森貝伽生物科技有限公司?；蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)分析試劑: RNAiso Plus, One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit (TaKaRa)等均購自大連寶生物有限公司。

1.3 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的影響

將白藜蘆醇溶解于DMSO配置成母液, 稀釋備用。取嗜水氣單胞菌NJ-35單菌落于NB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉3 g/L、氯化鈉5 g/L)中過夜培養(yǎng)(28℃, 180 r/min), 離心(3000 r/min, 5min)后棄上清, 用無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)菌A600=0.3。菌液按(1%v/v)接種量轉(zhuǎn)接至含白藜蘆醇(濃度分別為1024、512、256、128、64、32和16 μg/mL)的NB培養(yǎng)基中; 設(shè)置培養(yǎng)基內(nèi)不添加白藜蘆醇的空白對(duì)照組和添加等量DMSO的溶劑對(duì)照組; 控溫?fù)u床中(28℃、180 r/min)培養(yǎng)26h, 每2h取樣檢測(cè)A600值。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù), 根據(jù)取平均值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

根據(jù)Vasudevan等[18]的結(jié)晶紫染色法檢測(cè)菌株生物膜。菌液按(1%v/v)接種量轉(zhuǎn)接至含有白藜蘆醇(濃度分別為128、64、32 和16 μg/mL)的NB培養(yǎng)基中, 設(shè)置空白對(duì)照組和DMSO溶劑對(duì)照組。在充分混勻后, 轉(zhuǎn)入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 28℃靜置培養(yǎng)48h后, 吸出菌液并測(cè)定細(xì)胞濃度, 同時(shí)用無菌PBS清洗培養(yǎng)孔后, 先后用100 μL 40%甲醛固定15min, 1%結(jié)晶紫溶液染色5min; 干燥后加入100 μL 33%冰醋酸, 37℃ 孵育30min溶解結(jié)晶紫。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan G, Thermo Scientific)測(cè)定培養(yǎng)孔中溶液的A590值, 試驗(yàn)重復(fù)3次, 各試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。由于不同試驗(yàn)組細(xì)菌生長(zhǎng)存在差異, 每個(gè)樣品孔測(cè)得的A590值需要消除由細(xì)菌濃度造成的差異;生物膜A590(相對(duì)值)=A590(測(cè)量值)/A600(細(xì)菌濃度值)。

1.5 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌溶血活性的影響

根據(jù)Mao等[19]的試驗(yàn)方法檢測(cè)嗜水氣單胞菌NJ-35溶血活性。菌液按(1%v/v)接種量轉(zhuǎn)接至含有白藜蘆醇(濃度分別為128、64、32和16 μg/mL)的NB培養(yǎng)基中, 設(shè)置培養(yǎng)基內(nèi)不接種嗜水氣單胞菌的空白對(duì)照組和不添加白藜蘆醇的陽性對(duì)照組。搖床培養(yǎng)(28℃、180 r/min)8—16h, 調(diào)整各組A600值到1.0, 用過濾膜(0.22 μm)過濾除細(xì)菌細(xì)胞。將綿羊紅細(xì)胞用PBS稀釋成5%懸浮液, 37℃水浴30min。取50 μL細(xì)菌過濾液加入5 mL紅細(xì)胞懸液中, 37℃靜止孵育30min, 室溫下5000 r/min離心10min。取上清液測(cè)定A405值, 試驗(yàn)重復(fù)3次, 各試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。用此公式計(jì)算溶血百分比: H%=(AS-A0)/(A100-A0)(AS: 添加藥物組A405值,A0: 空白對(duì)照組A405值,A100: 陽性對(duì)照組A405值)。

1.6 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌毒力相關(guān)基因表達(dá)的影響

用無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)菌A600=0.3, 菌液按(1%v/v)接種量轉(zhuǎn)接至含白藜蘆醇(濃度為64 μg/mL)的NB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng), 對(duì)照組接入不含白藜蘆醇的NB培養(yǎng)基中; 5000 r/min離心1min, 棄上清, 根據(jù)RNAiso Plus試劑盒的操作說明, 提取細(xì)菌總RNA; 使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific,Wilmington, DE, USA)測(cè)定樣品RNA濃度并調(diào)整濃度至40 ng/μL, 凍存于-80℃?zhèn)溆?。以嗜水氣單胞菌rpob作為內(nèi)參基因, 檢測(cè)細(xì)菌溶血素基因hly, 外膜蛋白基因omp, 群感系統(tǒng)相關(guān)基因luxR、luxS、qseb表達(dá)量的變化。樣品RNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量分析溶液配制參照One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit (Takara)試劑盒的方法和步驟。熒光定量分析檢測(cè)采用ABI PRISM 7500 Real-time PCR Systeam儀器, 基因相對(duì)表達(dá)量分析用2-ΔΔCt方法; 試驗(yàn)所用引物見表 1。

1.7 白藜蘆醇對(duì)異育銀鯽的保護(hù)作用

異育銀鯽[(50±10) g; (10±1.5) cm]由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實(shí)驗(yàn)基地提供,在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴化2周, 水溫26℃。將試驗(yàn)魚隨機(jī)分為4組, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)30尾。在用病原菌嗜水氣單胞菌攻毒前1h, 每組分別注射白藜蘆醇(藥物∶魚體重: 0、25、50和100 mg/kg)。病原菌接種于無菌NB培養(yǎng)基中, 28℃、180 r/min培養(yǎng)18h, 離心收集細(xì)胞, 用無菌PBS調(diào)整濃度接近半致死量1×106CFU/mL, 每尾魚腹腔注射100 μL菌液, 攻毒后連續(xù)觀察7d, 記錄死亡量。7d后每組隨機(jī)采取21尾魚的肝臟和血清(3500 r/min, 15min)保存于-80℃?zhèn)溆?。根?jù)RNAiso Plus試劑盒的操作方法, 對(duì)肝臟樣品的總RNA進(jìn)行提取, 使用Nano-Drop 2000測(cè)定RNA的濃度后用Nuclear-free water調(diào)整濃度至40 ng/μL, 且A260/A280值在1.8—2.0,凍存于-80℃冰箱備用。β-actin作為內(nèi)參基因, 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒使用說明在ABI PRISM 7500 Real-time PCR Systeam儀器中檢測(cè)免疫相關(guān)基因TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-10 mRNA表達(dá)量變化, 數(shù)據(jù)分析用2-ΔΔCt方法, 試驗(yàn)所用引物見表 2。

表 1 熒光定量PCR所用引物Tab. 1 Primers used for quantitative PCR

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示, 其中毒力因子mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法比較分析; 其他數(shù)據(jù)使用軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn), 使用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)

如圖 1所示, 空白對(duì)照組和溶劑DMSO試驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線基本重合, 溶劑DMSO不影響嗜水氣單胞菌NJ-35的生長(zhǎng)。白藜蘆醇濃度≤32 μg/mL時(shí)對(duì)NJ-35的生長(zhǎng)沒有明顯的影響(P＞0.5), 在白藜蘆醇濃度≥64 μg/mL時(shí), 明顯抑制了嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng), 菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間出現(xiàn)了延遲, 且生長(zhǎng)平臺(tái)期菌液濃度明顯低于對(duì)照組(P＜0.5)。隨著白藜蘆醇濃度增加, 嗜水氣單胞菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間也隨之延遲, 且穩(wěn)定期的最大值也隨之降低。白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)明顯高于1024 μg/mL。

2.2 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

如圖 2所示, 溶劑DMSO對(duì)嗜水氣單胞菌NJ-35生物膜形成無顯著影響(P＞0.5), 白藜蘆醇濃度為16 μg/mL時(shí), 對(duì)NJ-35生物膜形成抑制率為2.5%, 與對(duì)照組相比無顯著差異(P＞0.5), 在白藜蘆醇濃度為32 μg/mL時(shí), 生物膜形成抑制率為12.4%, 與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.5)。在白藜蘆醇濃度為64和128 μg/mL時(shí), NJ-35生物膜抑制率分別為40.5%和44.6%, 差異顯著(P＜0.5)。

2.3 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌溶血活性的影響

如表 3所示, 溶劑DMSO試驗(yàn)組溶血率為98%,對(duì)嗜水氣單胞菌NJ-35溶血無明顯影響(P＞0.5); 白藜蘆醇濃度為16 μg/mL時(shí), 溶血率為94.8%, 抑制溶血效果不顯著(P＞0.5); 當(dāng)白藜蘆醇濃度為32 μg/mL時(shí), 溶血率為78.8%, 能顯著抑制NJ-35溶血活性(P＜0.5)。白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌NJ-35溶血活性的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴, 白藜蘆醇濃度越高抑制效果越強(qiáng)。

表 2 熒光定量PCR所用引物Tab. 2 Primers used for quantitative PCR

2.4 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌毒力相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 3所示, 菌株接種到含64 μg/mL白藜蘆醇的培養(yǎng)基后, 嗜水氣單胞菌NJ-35毒力相關(guān)基因表達(dá)呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。Ⅰ型群感系統(tǒng)相關(guān)基因luxR表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.5), Ⅱ型群感系統(tǒng)相關(guān)基因luxS、外膜蛋白o(hù)mp表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.5), 其中溶血素hly、Ⅲ型群感系統(tǒng)相關(guān)基因qseb下調(diào)不顯著(P＞0.5)。

2.5 白藜蘆醇對(duì)感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽死亡率的影響

如圖 4所示, 異育銀鯽攻毒后7d累計(jì)死亡率, 試驗(yàn)中對(duì)照組7d累計(jì)死亡率超過50%, 腹腔注射白藜蘆醇的處理組死亡率低于對(duì)照組, 其中注射濃度為25 mg/kg組的7d累計(jì)死亡率為29.1%, 50 mg/kg組7d累計(jì)死亡率為20.8%, 100 mg/kg組累計(jì)死亡率最低為12.5%。試驗(yàn)表明腹腔注射白藜蘆醇可降低異育銀鯽的死亡率。

2.6 白藜蘆醇對(duì)感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽肝臟基因表達(dá)量的影響

如圖 5所示, 異育銀鯽注射病原菌后肝臟組織中炎癥因子TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.5), 白藜蘆醇處理組TNF-α mRNA和IFN-γ mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.5); 其中TNF-α mRNA表達(dá)量在注射濃度為50 mg/kg白藜蘆醇時(shí)達(dá)到最低; IFN-γ mRNA表達(dá)量在注射濃度為100 mg/kg白藜蘆醇時(shí)達(dá)到最低。而抑制炎癥因子IL-10 mRNA表達(dá)量在注射嗜水氣單胞菌NJ-35后顯著降低, IL-10 mRNA表達(dá)量在注射濃度為50 mg/kg白藜蘆醇時(shí)達(dá)到最低。

3 討論

3.1 白藜蘆醇對(duì)病原菌的最小抑菌濃度

白藜蘆醇是一種天然多酚, 存在于多種植物中,具有廣譜抗菌作用(Anti-bacterial activity); 能顯著抑制多種致病菌的生長(zhǎng)、泳動(dòng)、毒力和生物膜形成等[20]。本研究首次報(bào)道了白藜蘆醇對(duì)水生動(dòng)物重要細(xì)菌病原嗜水氣單胞菌的抗菌作用。在此前的研究中, 白藜蘆醇對(duì)不同來源細(xì)菌菌株的最小抑菌濃度存在較大差異。如He等[21]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)的MIC值為100 μg/mL。Jung等[22]在對(duì)43株人畜來源細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn), 白藜蘆醇對(duì)其中40株菌的MIC≥1000 μg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC值與后者研究結(jié)果相似(≥1000 μg/mL)。由于1000 μg/mL接近白藜蘆醇在溶劑中的最大溶解濃度, 因此, 后續(xù)研究主要關(guān)注白藜蘆醇在低濃度條件下對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌作用。

表 3 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌溶血活性的影響Tab. 3 The effect of resveratrol on the hemolytic activity Aeromonas hydrophila

圖 1 嗜水氣單胞菌NJ-35在不同濃度的白藜蘆醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線Fig. 1 The effect of resveratrol on the growth of Aeromonas hydrophila NJ-35

圖 2 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌NJ-35生物膜形成的影響Fig. 2 The effect of resveratrol on the biofil formation of Aeromonas hydrophila NJ-351. 對(duì)照組control; 2. DMSO; 3. 16 μg/mL; 4. 32 μg/mL; 5. 64 μg/mL;6. 128 μg/mL

圖 3 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌NJ-35毒力相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of resveratrol on the virulence gene expression in Aeromonas hydrophila NJ-351. luxR; 2. luxS; 3. Hly; 4. Qseb; 5. Omp; 柱形圖的上標(biāo)“*”表示差異顯著mean significant difference, P＜0.05

3.2 白藜蘆醇影響病原菌群感調(diào)控系統(tǒng)基因表達(dá)

嗜水氣單胞菌具有復(fù)雜的群感調(diào)控系統(tǒng)(如Ⅰ型LuxR/I, Ⅱ型LuxS/AI-2和QseBC), 能根據(jù)菌體周圍環(huán)境中信號(hào)分子, 協(xié)同調(diào)控細(xì)胞群體的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性、毒力表達(dá)和生物膜生成等, 在病原菌致病過程中發(fā)揮重要作用[23—28]。研究表明嗜水氣單胞菌ahyⅠ基因缺失, 顯著降低影響Ⅰ型群感調(diào)控系統(tǒng)信號(hào)分子AHL表達(dá), 菌株致病性顯著下降[29]。王娜[25]研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌luxS基因缺失株在生物膜形成能力、黏附能力與溶血活性都出現(xiàn)減弱, 相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào)。同時(shí), 張小軍等[30]研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌luxS缺失株不產(chǎn)生Ⅱ型群感系統(tǒng)的信號(hào)分子AI-2, 并影響AHLs合成; 說明群感調(diào)控系統(tǒng)間具有一定交互調(diào)控作用。Ⅲ型群感系統(tǒng)(Qse-BC雙組分調(diào)控系統(tǒng))廣泛存在于革蘭氏陰性桿菌中, 參與細(xì)菌的毒力、鞭毛和生物膜的形成。本研究發(fā)現(xiàn)64 μg/mL白藜蘆醇處理嗜水氣單胞菌后, 其群感調(diào)控系統(tǒng)中l(wèi)uxR基因顯著上調(diào)表達(dá),luxS基因顯著下調(diào)表達(dá), 但QseB基因無顯著變化。這說明白藜蘆醇可以影響嗜水氣單胞菌Ⅰ型和Ⅱ型群感調(diào)控系統(tǒng)基因表達(dá)。

3.3 白藜蘆醇影響病原菌生物膜生成和毒力因子活性

圖 4 嗜水氣單胞菌攻毒后異育銀鯽累計(jì)死亡率Fig. 4 Cumulative mortality rate (%) of crucian carp after Aeromonas hydrophila challenge in 7 days

圖 5 肝臟組織炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化Fig. 5 The effect of resveratrol on the expression of Liver tissue inflammatory factors柱形圖上不同字母表示有顯著差異, P＜0.05Different letters indicate significant differences, P＜0.05

生物膜作為細(xì)菌一種十分重要的胞外結(jié)構(gòu), 參與細(xì)菌黏附、物質(zhì)運(yùn)輸以及自我保護(hù)等功能。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇(32—128 μg/mL)能顯著抑制嗜水氣單胞菌生物膜形成。白藜蘆醇對(duì)霍亂弧菌(Vibrio cholera)抑菌作用研究表明其可以通過與病原菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AphB相結(jié)合, 從而在不抑菌的情況下減弱細(xì)菌形成生物膜的能力[15]。白藜蘆醇濃度≥32 μg/mL時(shí), 嗜水氣單胞菌的溶血活性顯著降低, 但溶血素基因hly的表達(dá)量并沒有明顯的變化。嗜水氣單胞菌能夠分泌多種與溶血活性相關(guān)的毒力因子, 其中屬于溶血性毒素[25]的氣溶素和溶血素是最重要的致病因子[32]。它們主要通過作用于細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)與活性從而破壞細(xì)胞膜[25,33]或作為細(xì)胞膜孔蛋白導(dǎo)致大量離子涌入引起滲透失衡使細(xì)胞死亡[34]。有研究認(rèn)為氣溶素基因aer和絲氨酸蛋白酶基因ahpA是嗜水氣單胞菌具有致病力的關(guān)鍵基因, 而溶血素hly與嗜水氣單胞菌的致病力并不相關(guān)[5], 但也有研究者提出致病性嗜水氣單胞菌必定存在aer或hly基因[35], 同時(shí)存在aer和hly兩個(gè)基因時(shí)為強(qiáng)毒株[36]。嗜水氣單胞菌的溶血活性可能通過多個(gè)基因共同發(fā)揮作用。菌體外膜蛋白是嗜水氣單胞菌黏附宿主細(xì)胞主要作用因子和重要的免疫抗原[37,38]。白藜蘆醇(64 μg/mL)處理嗜水氣單胞菌后omp基因表達(dá)量下調(diào), 說明嗜水氣單胞菌受白藜蘆醇的影響?zhàn)じ侥芰p弱。在實(shí)驗(yàn)過程中, 作者發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物直接共同孵育, 并不能直接改變胞外產(chǎn)物的溶血活性(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此, 白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌溶血活性和生物膜形成的影響可能通過調(diào)控群感因子表達(dá)進(jìn)而影響下游毒力相關(guān)因子。

3.4 白藜蘆醇促進(jìn)魚體抗病原菌感染力

研究表明白藜蘆醇腹腔注射大鼠(20 mg/kg)1h后, 在心、肝、腎、腸等組織中都能檢測(cè)到白藜蘆醇, 且肝臟濃度最高, 達(dá)到6.72 μg/mL[39], 因此, 本研究采用白藜蘆醇腹腔注射濃度為20—100 mg/kg。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇對(duì)感染嗜水氣單胞菌的異育銀鯽有顯著保護(hù)作用, 藥物處理組死亡率都低于對(duì)照組。白藜蘆醇對(duì)異育銀鯽的保護(hù)作用可能從兩方面發(fā)揮作用, 一方面魚體組織分布的白藜蘆醇能減弱病原菌的毒力, 另一方面白藜蘆醇能降低魚體自身炎癥反應(yīng)。白藜蘆醇在人和其他動(dòng)物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)具有很好的抗炎癥作用。適度的機(jī)體炎癥反應(yīng)對(duì)抑制病原具有重要作用, 但長(zhǎng)期過高的炎癥因子表達(dá), 會(huì)損傷魚體甚至導(dǎo)致死亡[31]。Yu等[40]研究顯示, 大黃魚(Larimichthys crocea)高死亡率組脾臟組織中往往具有更高的促炎癥因子表達(dá)量, 這或許意味著炎癥因子表達(dá)量和死亡率也存在一定關(guān)系。TNF-α和IFN-γ都是促炎癥因子, 參與動(dòng)物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié), TNF-α被認(rèn)為是炎癥因子中的核心因子, 當(dāng)發(fā)生病原體感染時(shí), 炎癥細(xì)胞被激活后會(huì)釋放大量如TNF-α等的炎癥介質(zhì), 而且較嚴(yán)重的組織中往往會(huì)有更高的TNF-α蛋白表達(dá)量和TNF-αmRNA表達(dá)量[41]。楊智景等[42]在對(duì)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染香魚(Plecoglossus altivelis)的研究中發(fā)現(xiàn)血清和巨噬細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)量和TNF-α蛋白表達(dá)量同步上升。本研究中白藜蘆醇處理組促炎癥因子TNF-αmRNA和IFN-γmRNA表達(dá)量顯著下調(diào), 表明白藜蘆醇可以減弱因病原菌感染而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng), 從而減輕因炎癥而導(dǎo)致的魚體損傷。Zhang等[43]研究證明白藜蘆醇可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路中p65和IκB的磷酸化以及MAPK信號(hào)通路中p38和ERK的磷酸化, 降低LPS誘導(dǎo)引起的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。Zheng等[44]研究發(fā)現(xiàn)飼料添加白藜蘆醇(0.1 g/kg)能上調(diào)吉富羅非魚肝臟組織中IL-10 mRNA等抗炎因子的表達(dá)量, 降低促炎癥因子TNF-α和IFN-γmRNA的表達(dá)。

綜上所述, 白藜蘆醇≥32 μg/mL時(shí), 對(duì)嗜水氣單胞菌致病力具有顯著抑制作用, 對(duì)受嗜水氣單胞菌感染的異育銀鯽有明顯保護(hù)作用。白藜蘆醇在預(yù)防和治療水生動(dòng)物由嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌敗血癥具有重要的應(yīng)用價(jià)值。