王欣 何來鵬 吳志毅 鐘瓊 曾今成 楊維青,*

(1 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湛江 523000；2 廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)附屬醫(yī)院，湛江 524001；3 廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，東莞523808；4 廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所東莞市醫(yī)學(xué)活性分子開發(fā)與轉(zhuǎn)化重點實驗室，東莞 523808)

解脲支原體(Ureaplasma urealyticum,Uu)是寄居在成年女性生殖道的正常微生物群，女性生殖道內(nèi)微環(huán)境紊亂時常會引起婦科炎癥，該菌還可通過胎盤感染胎兒而導(dǎo)致早產(chǎn)、死胎，或在分娩時感染新生兒[1]。近年來，由于支原體感染及臨床抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致支原體的耐藥狀況較為普遍[2-3]。國外文獻(xiàn)報道支原體可形成生物被膜，生物被膜的形成可降低其對藥物的敏感性[4-8]，國內(nèi)的相關(guān)報道不多。本研究對臨床分離的解脲支原體進(jìn)行生物被膜形成能力分析，并檢測其在生物被膜狀態(tài)下的藥物敏感性變化，為解脲支原體的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

四環(huán)素、紅霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品(上海紫一試劑廠產(chǎn)品)，按藥物特性溶解原藥，過濾除菌后，將藥物稀釋為5120mg/L，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。Uu液體選擇性培養(yǎng)基為珠海迪爾生物工程公司產(chǎn)品。

1.2 菌株來源和分離及鑒定

25株Uu臨床菌株，取2016年9月—2017年9月廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)附屬醫(yī)院門診婦科疾病的女性患者陰道分泌物標(biāo)本，使用Uu分離培養(yǎng)試劑盒對標(biāo)本進(jìn)行Uu的培養(yǎng)和初步鑒定；采用固體培養(yǎng)法進(jìn)行分離：將陽性Uu培養(yǎng)物用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液轉(zhuǎn)種于A7瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，待培養(yǎng)基由淡淺黃色變成淡紫色時，在顯微鏡下觀察，若有黑褐色海膽樣菌落生長，判為Uu陽性；挑取單個菌落接種Uu液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待培養(yǎng)基變?yōu)槌燃t色時加入滅菌甘油，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Uu菌株生物被膜形成能力分析

參考文獻(xiàn)方法[9]對25株Uu臨床菌株進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)。將Uu菌株接種液體培養(yǎng)基，5% CO2溫箱中37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，收獲菌株。用支原體培養(yǎng)基將菌液終濃度調(diào)為104CCU/mL(104～105CFU/mL)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，陰性對照孔為培養(yǎng)基，每孔加入兩滴無菌石蠟油。常規(guī)培養(yǎng)，每隔24h進(jìn)行換液，培養(yǎng)72h。吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS輕輕沖洗，除去浮游菌。每孔加入0.5%結(jié)晶紫染液1mL，染色20min，用無菌PBS沖洗。每孔加入1mL無水乙醇，脫色10min；用酶標(biāo)儀測定結(jié)晶紫析出液在560nm波長處的吸光值(A560)；每個試驗設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.4 Uu菌株生物被膜藥物敏感性檢測

1.4.1 Uu菌株在浮游狀態(tài)下的藥物敏感性檢測

采用微量稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行藥敏試驗。將四環(huán)素、紅霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素進(jìn)行倍比稀釋；對Uu菌株培養(yǎng)液進(jìn)行計數(shù)并調(diào)節(jié)菌液濃度，等量加入不同濃度的藥物中，設(shè)不加藥物的對照孔，菌液的終濃度為104CCU/mL，藥物的終濃度為0.0625～64mg/L。每孔滴加無菌液體石蠟。37℃恒溫箱中孵育48h后觀察結(jié)果，待對照孔培養(yǎng)基發(fā)生顏色改變時，讀取藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，以無顏色變化孔的最低藥物濃度定為MIC，耐藥、敏感的判讀標(biāo)準(zhǔn)參考珠海迪爾生物工程公司支原體分離培養(yǎng)藥敏試劑盒(表1)。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 Uu菌株在生物被膜狀態(tài)下的藥物敏感性檢測

參照文獻(xiàn)[6]方法檢測Uu菌株在生物被膜狀態(tài)下的藥物敏感性。使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Uu菌株生物被膜，分別在每個孔中加入200μL液體培養(yǎng)基及Uu菌株菌液(菌液終濃度濃度為104CCU/mL)，每孔滴加無菌液體石蠟，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)，每24h用液體培養(yǎng)基進(jìn)行換液，培養(yǎng)至48h。用微量吸液器吸棄培養(yǎng)液，用PBS溶液輕輕沖洗3次。每孔加入200μL含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)基，對照孔不加抗生素。藥物的終濃度為0.0625～64mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)至對照孔培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色變化，此時讀取最小生物被膜藥物抑制濃度(minimal biof ilm inhibitory concentration,MBIC)。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用配對秩和檢驗及χ2檢驗分別比較Uu菌株在浮游狀態(tài)下MIC和在生物被膜狀態(tài)下MBIC及其耐藥率間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 解脲支原體藥物敏感性判讀標(biāo)準(zhǔn)(mg/L)Tab.1 Sensitivity standard for drug dilution for U.urealyticum

2 結(jié)果

2.1 Uu菌株的生物被膜形成能力

參考文獻(xiàn)[9]方法將A560≤0.15者定為無生物被膜形成，A560＞0.15者為有生物被膜形成。在所檢測的25株Uu中，16株Uu生物被膜培養(yǎng)物的結(jié)晶紫析出液在560nm波長處的吸光值A(chǔ)560＞0.15，參考文獻(xiàn)[9]方法確定為有生物被膜形成，陽性率為64%(16/25)；9株Uu生物被膜培養(yǎng)物的結(jié)晶紫析出液在560nm波長處的吸光值A(chǔ)560≤0.15者，定為無生物被膜形成(圖1)。

2.2 Uu 菌株在浮游狀態(tài)下和生物被膜狀態(tài)下的藥物敏感性比較

16株能生物被膜形成的Uu菌株，其在浮游狀態(tài)和在生物被膜培養(yǎng)狀態(tài)下對所選4種抗生素的體外藥敏試驗結(jié)果見表2～3。結(jié)果顯示：絕大多數(shù)Uu臨床菌株在生物被膜形成后對四環(huán)素和左氧氟沙星MBICs，較其浮游狀態(tài)下MICs增加約4～8倍或以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，對紅霉素和阿奇霉素MBICs增加0～2倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；依據(jù)Uu稀釋法藥物敏感性判讀標(biāo)準(zhǔn)，Uu臨床菌株在生物被膜形成后對四環(huán)素、左氧氟沙星的耐藥率顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；對紅霉素、阿奇霉素耐藥率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

9株形成不能生物被膜的Uu菌株，在浮游狀態(tài)和生物被膜培養(yǎng)狀態(tài)下對所選4種抗生素體外藥敏試驗的MIC和MBIC值略有增加，二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；對所選4種抗生素耐藥率的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(具體數(shù)據(jù)略)。

3 討論

圖1 Uu生物被膜培養(yǎng)物結(jié)晶紫染色(放大倍數(shù)：10×60)Fig.1 Biof ilm of Uu strains(magnification:10×60)

表2 16株Uu的MIC與MBIC結(jié)果(mg/L)Tab.2 The MIC and MBIC of 16 U.urealyticum isolates(mg/L)

表3 Uu在浮游狀態(tài)與生物被膜狀態(tài)下的耐藥率Tab.3 The drug resistance rate of U.urealyticum isolates in fl oating and biof ilm state

多數(shù)細(xì)菌在機(jī)體內(nèi)可形成生物被膜，與液相單個生長的浮游菌相比，生物被膜細(xì)菌群體對抗生素表現(xiàn)出高度的不敏感和較強(qiáng)的免疫逃逸能力[4,10]。研究表明，細(xì)菌在生物被膜狀態(tài)下對藥物的MBICs與浮游狀態(tài)下的MICs值存在較大差距，兩種狀態(tài)下對抗菌藥物的敏感性不完全相同[4,10]。Uu可借助自身分泌的黏附素與宿主細(xì)胞表面的黏附素受體結(jié)合固著在機(jī)體細(xì)胞表面形成生物被膜[4]。本研究在所檢測的Uu臨床分離株中有64.0%可行形成生物被膜，Uu生物被膜對藥物敏感性的變化值得關(guān)注。

本研究選擇Uu臨床治療常用的3大類抗菌藥物中的4種：四環(huán)素、紅霉素、阿奇霉素和左氧氟沙星，進(jìn)行Uu臨床菌株生物被膜狀態(tài)下的MBICs檢測。不能形成生物被膜的Uu菌株，在浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)培養(yǎng)下對所選4種抗生素體外藥敏試驗的MIC和MBIC值略有增加，二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，對所選4種抗生素耐藥率的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。而絕大多數(shù)能形成生物被膜的Uu菌株在生物被膜形成后對四環(huán)素和左氧氟沙星MBICs顯著高于其浮游狀態(tài)下MICs，其耐藥率顯著提高。對紅霉素和阿奇霉素MBICs增加無差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Uu生物被膜形成后對阿奇霉素的抑菌濃度雖有所提高，但還沒有達(dá)到耐藥的標(biāo)準(zhǔn)，所以對阿奇霉素仍是敏感的；生物被膜形成后多數(shù)支原體表現(xiàn)出對2種或3種藥物的同時耐藥的現(xiàn)象。關(guān)于Uu生物被膜形成后對四環(huán)素和左氧氟沙星的耐藥率顯著提高，以及表現(xiàn)出多重耐藥的結(jié)果，與關(guān)于相關(guān)報道一致[5,7-8]。

細(xì)菌生物被膜形成后對不同種類抗菌藥物敏感性的變化，一方面與生物被膜菌的特性有關(guān)，另一方面與藥物的化學(xué)特性、抗菌機(jī)制有關(guān)[8,10-11]。成熟生物被膜菌群某些基因的表達(dá)和表型與浮游菌不同，這些變化可能形成新的變種，有些與提高菌體的抗性有關(guān)，如大量胞外多糖的產(chǎn)生和聚集，減低了抗菌藥物的滲透；生物被膜內(nèi)中營養(yǎng)物質(zhì)和氧分壓的降低，使被膜內(nèi)部的菌體的代謝活性和生長速度下降，使菌體對藥物敏感性降低；群體感應(yīng)系統(tǒng)的激活進(jìn)而調(diào)節(jié)某些基因的活化或抑制等，如與耐藥相關(guān)的基因的高表達(dá)等。在抗菌藥物方面，喹諾酮類藥物雖然對細(xì)菌生物被膜有較好的滲透性[5]，但該類藥物的抗菌機(jī)制干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制，是繁殖期抑菌劑，而生物被膜菌代謝緩慢、繁殖速度下降，因此Uu在生物被膜狀態(tài)下對左氧氟沙星這類喹諾酮類藥物敏感性下降。四環(huán)素和紅霉素都為靜止期抑菌劑，但因分子量較大，不易進(jìn)入生物被膜的基質(zhì)內(nèi)，同時細(xì)菌對二者的MIC值與該藥在體內(nèi)的治療濃度的下限即敏感折點較接近，因此不難解釋生物被膜形成后細(xì)菌對其表現(xiàn)出耐藥的現(xiàn)象。本研究中Uu形成生物被膜后仍表現(xiàn)出對阿奇霉素敏感，與Pandelidis等[7]的研究結(jié)果類似。阿奇霉素與紅霉素同屬于大環(huán)內(nèi)酯類藥物，本研究結(jié)果中Uu生物被膜狀態(tài)下對阿奇霉素仍是敏感的，其中的原因可能是：大多數(shù)Uu對阿奇霉素的MIC與該藥在體內(nèi)的治療濃度的下限即敏感折點差距較遠(yuǎn)，而Uu對紅霉素MIC與該藥敏感折點差距很近，同時阿奇霉素有具有良好的抗生素后效應(yīng)。關(guān)于Uu生物被膜對藥物的敏感性下降的機(jī)制還待進(jìn)一步研究。

目前，國內(nèi)醫(yī)院對Uu的藥敏試驗是針對浮游菌進(jìn)行的，而多數(shù)支原體具有形成生物被膜的能力。因此，如不考慮Uu在感染機(jī)體易形成生物被膜的特性，只依據(jù)傳統(tǒng)方法測得的MIC指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用，對Uu生物被膜菌感染很難達(dá)到滿意的療效。為提高Uu的臨床治療效果，在臨床實踐中，一方面在進(jìn)行Uu藥敏試驗的同時，應(yīng)該對Uu菌株生物被膜形成能力進(jìn)行檢測；另一方面，當(dāng)依據(jù)傳統(tǒng)藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行Uu抗菌藥物治療效果欠佳時，有必要考慮Uu生物被膜形成的可能，選用對生物被膜敏感的抗菌藥物。