陳德龍 陳鵬 王粵淇 王海彬
1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510405
2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州510405
非編碼 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子,近20年來,具有調(diào)控作用的非編碼RNA分子被發(fā)現(xiàn)及其功能研究,大大改變了人們對RNA分子的認(rèn)知,也極大深化了人們對基因表達(dá)調(diào)控的理解。其中,環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類通常由一個(gè)以上外顯子構(gòu)成的環(huán)形RNA分子,概念最初是由Sanger等[1]于1976年提出的,他發(fā)現(xiàn)某些高等植物的類病毒是單鏈、共價(jià)閉合的環(huán)狀 RNA分子。然后在1979年通過使用電子顯微鏡驗(yàn)證了環(huán)狀RNA存在于幾個(gè)真核細(xì)胞中[2]。1986年,在感染丁型肝炎病毒后,人類首次觀察到circRNA[3]。在真核生物中,規(guī)范剪接由剪接體去除內(nèi)含子并將外顯子連接成線性 RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。20多年前,Nigro等[4]發(fā)現(xiàn)circRNA時(shí),人們認(rèn)為它是錯(cuò)誤剪接生成的副產(chǎn)品或逃逸內(nèi)含子套索的中間產(chǎn)物。自2012年以來,隨著生物信息學(xué)和高通量測序的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,這種觀點(diǎn)發(fā)生了巨大變化[5]。最近的許多報(bào)道證明了circRNA在病理生理學(xué)中的重要性,這些circRNA可以作為 miRNA海綿發(fā)揮作用[6-7],調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)[8-9],有些甚至翻譯成蛋白質(zhì)[10-11]。circRNA參與各種疾病的發(fā)病機(jī)制,具有序列高度保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高、有一定的組織特異性和疾病特異性[12],使它們成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。circRNA作為疾病診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)也具有潛在的價(jià)值[13]。本文簡要描述了circRNA的特征、生物起源、分類和功能,并且強(qiáng)調(diào)了circRNA與多種骨科疾病之間的關(guān)系。
circRNA廣泛存在于真核細(xì)胞中,通常由1~5個(gè)外顯子產(chǎn)生[14],主要位于細(xì)胞質(zhì)中[5],少部分含有內(nèi)含子的circRNA起源于細(xì)胞核[9]。circRNA的長度在幾百到幾千個(gè)核苷酸之間[15],平均547個(gè)核苷酸[14],大多數(shù)circRNA的半衰期超過48 h。重要的是,circRNA來自非規(guī)范的可變剪接,其將剪接供體連接至上游剪接受體并形成共價(jià)閉合環(huán),沒有5’帽子或3’多聚A尾,并通過共價(jià)鍵環(huán)化。這些特征賦予circRNA對核酸外切酶RNase R的抗性,在組織和血漿中更穩(wěn)定。而且circRNA在細(xì)胞、組織中廣泛表達(dá)[16-17],具有成為生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的潛力。
circRNA的生成與可變剪接相關(guān),而可變剪接是真核基因表達(dá)中必不可少的步驟,它受到剪接體和核糖酶的調(diào)控。circRNA由外顯子、內(nèi)含子、基因間區(qū)域、以及 5’或 3’非翻譯片段產(chǎn)生[9,18]。circRNAs主要分為3類:外顯子環(huán)狀 RNA(exonic circular RNAs,ecircRNAs)、內(nèi) 含 子 環(huán) 狀 RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀 RNA(exon-intron circular RNAs,EIciRNAs)。
大多數(shù)ecircRNA來自外顯子,關(guān)于ecircRNA生物合成已經(jīng)提出了3個(gè)主要模型:(1)套索驅(qū)動環(huán)化(也稱為外顯子跳躍)。它是位于5’端的外顯子受體和位于3’端外顯子供體兩者共價(jià)結(jié)合后形成含外顯子的套索中間體,然后去除套索中的內(nèi)含子以產(chǎn)生ecircRNA[12]。(2)內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化(也稱為直接反向剪接)。通過側(cè)翼內(nèi)含子的直接堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),然后切除環(huán)內(nèi)反向剪接的內(nèi)含子,從而產(chǎn)生ecircRNA[12]。(3)重新剪接驅(qū)動環(huán)化。在通過經(jīng)典前mRNA剪接合成成熟mRNA后,發(fā)生反向剪接和環(huán)化,導(dǎo)致ecircRNA形成[19]。一些RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein,RBP)在此過程中充當(dāng)調(diào)節(jié)因子,例如muscleblind(MBL)剪接因子可以將側(cè)翼內(nèi)含子生成的circMbl前體環(huán)化成circMbl,并且circRNA的生成受到MBL表達(dá)水平的調(diào)控[20]。RBP與前mRNA的側(cè)翼內(nèi)含子內(nèi)的特定序列結(jié)合,可以通過穩(wěn)定剪接或抑制線性RNA來調(diào)節(jié)circRNA形成。
EIciRNA的生物合成與ecircRNA過程類似,唯一的區(qū)別在于內(nèi)含子是完全剪接(ecircRNA)或部分剪接(EIciRNA)。與外顯子circRNA形成不同,ciRNA的產(chǎn)生主要取決于內(nèi)含子兩端的共有基序,即5’剪接位點(diǎn)附近存在一段7nt左右富含GU堿基的結(jié)構(gòu),分支點(diǎn)附近存在一段11nt左右富含C堿基的結(jié)構(gòu)。因此,ciRNA不是以3’-5’磷脂結(jié)合,而是以 2’-5’磷脂連接[9]。
circRNA影響剪接過程,是選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它們不僅可以增強(qiáng)線性RNA的轉(zhuǎn)錄,而且還能抑制它們的轉(zhuǎn)錄。外顯子circRNAs是主要種類,在合成過程中與規(guī)范剪接互相競爭(見圖1)。一方面,規(guī)范剪接修飾前mRNA,形成線性RNA,外顯子對這一過程必不可少;另一方面,當(dāng)circRNA和線性RNA的形成需要共同的外顯子時(shí),需要相互競爭。此外,這兩個(gè)過程可能共享相同的位置[21]。對于由內(nèi)含子(如ciRNA和EIciRNA)形成的circRNA,一些研究揭示了這些circRNAs能調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)。已經(jīng)證明的ciRNA或EIciRNA,例如c-sirt7可以與聚合酶II復(fù)合物相互作用,相應(yīng)基因錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域52(ankyrin repeat domain 52,ANKRD52)和去乙酰化酶 7(sirtuin 7,SIRT7)的表達(dá)水平下降[22]。如上所述,在circRNA形成期間,調(diào)節(jié)其親本基因的表達(dá),這是circRNA在其他功能中發(fā)揮作用的先決條件之一。
miRNA作為在轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子,它可以根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合到互補(bǔ)的mRNA位點(diǎn)上[23-24],miRNA的改變會調(diào)控mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。circRNA是一種擁有miRNA反應(yīng)原件(microRNA response element,MREs)的競爭性內(nèi)源性 RNA分子,具有 miRNA海綿作用。ceRNA的缺失和出現(xiàn)會通過影響miRNA功能活性從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。具有互補(bǔ)序列的circRNA可以與其靶miRNA結(jié)合,從而抑制這些miRNA的功能[25]。然而,海綿作用是否是circRNA的普遍功能仍在討論中。
圖1 CircRNA生物學(xué)功能示意圖(自擬)Fig.1 Biological function of circRNA
CiRS-7也稱為CDR1as,已經(jīng)被證明可以作為miRNA海綿的典型例子[26-27]。具有超過70個(gè)常規(guī)miR-7結(jié)合位點(diǎn)的CiRS-7由CDR1as基因的反義轉(zhuǎn)錄物形成[26]。此外,CIR-7不能被miRNA-7介導(dǎo)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物體(RNA-induced silencing complex,RISC)降解[28]。miR-7 是眾多信號通路中的關(guān)鍵參與者之一,ciRS-7-miR-7軸廣泛表達(dá)于各種癌癥,如非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌[29-30]。
circRNA還可以作為RNA結(jié)合蛋白的海綿來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平。RBP可參與許多生物活性,例如細(xì)胞增殖、分化,細(xì)胞凋亡、衰老,細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。據(jù)報(bào)道,circRNA可以結(jié)合多個(gè)RBPs,例如 RNA 聚合酶 II(RNA polymerase II,Pol II)、Argonaute(AGO)蛋白、MBL、RNA結(jié)合蛋白Quaking(QKI)等,通過相互作用形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種與RBPs的相互作用類似與miRNA海綿,導(dǎo)致RBPs的消耗和減少與RNA靶標(biāo)的互相作用。在蒼蠅和人類中發(fā)現(xiàn)的circMBL可以在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合MBL蛋白[25]。另外,CDR1As可以連接和切割miRNA AGO蛋白,抑制其翻譯并促進(jìn)其降解[18]。
circRNA可以與蛋白質(zhì)相互作用以影響細(xì)胞行為。例如circ-FOXO3通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)和 CDK 抑制劑P21結(jié)合,阻礙CDK2使細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E磷酸化,從而抑制細(xì)胞周期[31]。
circRNA可能不是真正的一類ncRNA,因?yàn)槠渲杏幸恍ヽircRNA可以翻譯蛋白質(zhì)。早在1995年,研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)circRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)元件時(shí),真核生物核糖體能啟動翻譯[32]。當(dāng)將IRES插入含有裂解GFP的小基因中時(shí),得到的circRNA能產(chǎn)生大量的GFP蛋白[33]。盡管已經(jīng)進(jìn)行了一些研究,但是circRNA的翻譯細(xì)節(jié)仍然未知,仍需進(jìn)一步探索。
轉(zhuǎn)錄因子BMP2屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族,是重要的人類細(xì)胞因子之一。它能誘導(dǎo)骨和軟骨形成,并在胚胎生長、細(xì)胞生長和分化、骨發(fā)育和骨折修復(fù)中發(fā)揮重要作用。用BMP2處理的MC3T3-E1細(xì)胞共有158個(gè)差異表達(dá)的circRNA,其中74個(gè)上調(diào),84個(gè)下調(diào)。在 BMP2處理后,PCR驗(yàn)證 hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和 hsa_circ_0010042的表達(dá)顯著增加。hsa_circ_0005846和hsa_circ_0 019 142分別與51和21個(gè)miRNA相互作用,并且都海綿樣作用于 miR-7067-5p,參與 FGF、EGF、PDGF 和Wnt信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化[34]。
在小鼠破骨細(xì)胞發(fā)育的不同階段存在共同表達(dá)的circRNA。circRNA-miRNA協(xié)同作用在破骨細(xì)胞形成中起重要作用。對于破骨細(xì)胞前期,147個(gè)circRNA和119個(gè)miRNA上調(diào),109個(gè)circRNA和941個(gè)miRNA下調(diào)。對于成熟的破骨細(xì)胞,78個(gè)circRNA和38個(gè)miRNA上調(diào),135個(gè)circRNA和24個(gè)miRNA下調(diào)。對于活化的破骨細(xì)胞,111個(gè)circRNA和94個(gè)miRNA上調(diào),45個(gè)circRNA和975個(gè)miRNA下調(diào)。在OC發(fā)生過程中的所有階段,19個(gè)circRNAs和22個(gè)miRNAs都上調(diào),5個(gè)circRNAs和 15miRNAs都下調(diào)[35]。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞,廣泛運(yùn)用于組織工程研究,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化是骨再生的希望。Zhang等[36]利用RNA-seq技術(shù)探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化過程中明顯異常表達(dá)的circRNAs和miRNAs,在第0天和第7天的比較中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的共有3 938個(gè)上調(diào)的circRNAs,1 505個(gè)下調(diào)的circRNAs和42個(gè)上調(diào)的miRNAs,18個(gè)下調(diào)的miRNAs。通過ALP染色和茜素紅染色證實(shí)沉默circIGSF11促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化并增強(qiáng)miR-199b-5p的表達(dá)。
人骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)軟骨中存在許多異常表達(dá)的circRNA,這些circRNA可能參與了OA的發(fā)病機(jī)制。在一項(xiàng)研究中,Liu等[37]發(fā)現(xiàn)與正常軟骨相比,總共有71個(gè)circRNA在OA軟骨中差異表達(dá),其中有16個(gè)上調(diào),55個(gè)下調(diào)。其中OA中circRNA-CER的表達(dá)是正常組的2.5倍。白介素1(Interleukin-1,IL-1)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)是 OA 關(guān)鍵的炎性介質(zhì),在IL-1和TNFα刺激軟骨細(xì)胞下,CircRNA-CER靶向miR-136調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶 3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、軟骨Ⅱ型膠原蛋白(collagen type II,COL2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表達(dá)降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。另一項(xiàng)研究中,在骨關(guān)節(jié)炎病人中,受損的軟骨相比完整的軟骨共有104個(gè)circRNAs差異表達(dá),其中44個(gè)上調(diào),60個(gè)下調(diào)。軟骨細(xì)胞在應(yīng)力刺激下,circRNA-MSR表達(dá)增加,并可抑制TNF-α的表達(dá)并增加ECM的形成,增加COL2和Aggrecan的表達(dá)量[38]。
炎癥是OA軟骨病理學(xué)的重要驅(qū)動因素。eNAMPT也被稱為visfatin,在人類OA軟骨細(xì)胞中抑制蛋白多糖的合成并增加基質(zhì)降解酶的表達(dá)。has-circ-0005105不僅可以促進(jìn)NAMPT的表達(dá),而且可以促進(jìn)前列腺素E2、IL-6和IL-8的產(chǎn)生。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞數(shù)量減少在OA軟骨組織的退化中起重要作用[39]。Li等[40]報(bào)道 has_circ_0045714可通過miR-193b靶基因IGF1R促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制軟骨細(xì)胞凋亡。
骨肉瘤(osteosarcoma,OS)已成為兒童及青少年時(shí)期死亡率最高的癌癥,具有局部侵蝕性和易于全身轉(zhuǎn)移的特征。Caspase-1是一種半胱氨酸蛋白酶,已被證明能夠蛋白水解并激活I(lǐng)L-1β和IL-18等炎性細(xì)胞因子,從而導(dǎo)致形成炎性微環(huán)境,在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)。circ-0016347海綿樣作用于miR-214,上調(diào)具有致癌潛力半胱天蛋白酶-1(caspase-1)的表達(dá),促進(jìn)骨肉瘤的增殖和侵襲[41]。在骨肉瘤患者中,circHIPK3的表達(dá)與 Enneking分期(P=0.042)和肺轉(zhuǎn)移(P=0.036)顯著相關(guān)。ROC曲線下面積為0.783,靈敏度和特異度分別為0.56和0.84。Kaplan-Maier分析還顯示circHIPK3的低表達(dá)與OS患者的總體存活時(shí)間和預(yù)后較差相關(guān)。此外,功能分析表明circHIPK3過表達(dá)顯著抑制體外OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[42]。在另外一項(xiàng)研究中,circUBAP2可以作為miR-143的海綿發(fā)揮作用并抑制miR-143的表達(dá),從而上調(diào)骨肉瘤中抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡[43]??傊?,circRNA在骨肉瘤診斷和預(yù)后方面具有重要價(jià)值,未來的工作中需要更多的樣本來進(jìn)一步確定circRNA的作用。
隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步,對circRNA的研究越來越受到關(guān)注。circRNA形成的機(jī)制是多種多樣的,產(chǎn)生不同類型的circRNA具有不同的功能,例如調(diào)節(jié)線性RNA轉(zhuǎn)錄、miRNA和蛋白質(zhì)海綿、翻譯蛋白質(zhì)等。這些復(fù)雜的功能使circRNA能夠通過各種信號通路參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展,特別是對于骨科疾病,為骨科疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高、有一定的組織特異性和疾病特異性,可能成為臨床診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),但目前均是體外研究,結(jié)果需要在體內(nèi)驗(yàn)證。因此,為了充分了解circRNA在骨科疾病發(fā)展中的分子機(jī)制,必須進(jìn)行更廣泛的研究。