盛雨璐，鮑 靜，王鴻俠，劉靜怡，施時迪

（臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000）

目前，我國土壤污染的總體形勢嚴(yán)峻，由土壤污染引發(fā)的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題和群體性事件逐年增多［1］。農(nóng)藥的廣泛使用在為農(nóng)業(yè)發(fā)展和人類糧食供給做出巨大貢獻(xiàn)的同時，也對土壤造成了不同程度的污染，是社會與公眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題［2］。土壤動物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要成分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡維持中起重要作用。蚯蚓是重要的土壤動物，約占土壤生物量的60%-80%，其生存活動可促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解、土壤養(yǎng)分的循環(huán)與釋放、改善土壤結(jié)構(gòu)和土壤的理化性狀，在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能中起著不可替代的作用［3］。由于赤子愛勝蚓對毒物敏感、體型較大，且具有標(biāo)準(zhǔn)的急毒性和亞急毒性測定方法，常被作為生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)物種［4］。因此，國內(nèi)外不少學(xué)者將赤子愛勝蚓作為土壤污染狀況的重要指示生物進(jìn)行研究［5］，并通過對蚯蚓的生態(tài)毒理學(xué)研究反映所測污染物的毒性效應(yīng)及土壤的污染狀況［6］。

以赤子愛勝蚓為研究對象，探索唑醚·代森聯(lián)、2-甲-4-氯鈉、噁霉靈、苯醚甲環(huán)唑、福美雙、烯酰嗎啉、農(nóng)用硫酸鏈霉素和滅蠅胺等8種常用農(nóng)藥對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)；旨在明確這些農(nóng)藥對蚯蚓毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系，及其在環(huán)境中的安全濃度（safe concentration,SC）。研究結(jié)果不僅為農(nóng)藥殘留對環(huán)境的影響提供科學(xué)依據(jù)，也可為整個土壤動物區(qū)系安全閾值的確定提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試生物

實(shí)驗(yàn)所用赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）由江蘇省句容市王軍蚯蚓養(yǎng)殖場提供。實(shí)驗(yàn)選擇體重為400 mg～500 mg，環(huán)帶明顯且大小較為一致的健康成蚓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 受試農(nóng)藥

唑醚·代森聯(lián)72%唑醚·代森聯(lián)為代森聯(lián)（含量66%）和吡唑醚菌酯（含量6%）混配而成的殺菌劑，屬于水分散粒劑，由陜西湯普森生物科技有限公司生產(chǎn)。

苯醚甲環(huán)唑苯醚甲環(huán)唑是有效成分為60%的殺菌劑，屬于水分散粒劑，由海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)。

烯酰嗎啉烯酰嗎啉是有效成分為80%的殺菌劑，屬于水分散粒劑，由江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

霉靈是有效成分為70%的殺菌劑，屬于可濕性粉劑，由天津市綠亨化工有限公司生產(chǎn)。

2-甲-4-氯鈉2-甲-4-氯鈉是有效成分為56%的除草劑，屬于可溶性粉劑，由安徽華星化工有限公司生產(chǎn)。

福美雙福美雙是有效成分為80%的殺菌劑，屬于水分散粒劑，由比利時特胺有限公司生產(chǎn)。

滅蠅胺滅蠅胺是有效成分為50%的殺蟲劑，屬于可濕性粉劑，由浙江樂吉化工股份有限公司生產(chǎn)

農(nóng)用硫酸鏈霉素農(nóng)用硫酸鏈霉素是有效成分為72%的殺菌劑，屬于可溶性粉劑，由重慶豐化科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 受試農(nóng)藥質(zhì)量濃度設(shè)計

正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的最小致死濃度和最大存活濃度，按照等差法設(shè)計質(zhì)量濃度梯度序列進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，8種農(nóng)藥的濃度梯度設(shè)計見表1。

表1 受試農(nóng)藥的實(shí)驗(yàn)濃度（μg試農(nóng)藥-2）Table 1 The concentrations of tested pesticides（μg·cm-2）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)濾紙法

標(biāo)準(zhǔn)濾紙法參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）207的方法［7］，并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。向底部鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑150 mm×高25 mm）中加入5 mL蒸餾水。將赤子愛勝蚓洗凈放在濾紙上，用塑料薄膜封口，并用解剖針將塑料薄膜扎孔，將培養(yǎng)皿放入溫度為（20±1）℃，濕度為80%～85%的恒溫培養(yǎng)箱中清腸24 h。

在直徑150 mm的培養(yǎng)皿中墊入直徑為150 mm的一層濾紙。將清腸后的赤子愛勝蚓清洗干凈，用濾紙吸去多余水分，每個培養(yǎng)皿放10條赤子愛勝蚓，并用塑料薄膜封口，用解剖針在塑料薄膜上扎孔，然后將其置于（20±1）℃，濕度為80%～85%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個濃度設(shè)3個重復(fù)，同時設(shè)空白對照組，定期觀察。在24 h、48 h分別觀察記錄死亡數(shù)，以前尾部對機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics22中的概率單位法（Probit）。分析得到農(nóng)藥對蚯蚓的急性毒性線性回歸方程、半數(shù)致死濃度（Lethal Concentration 50，LC50）和95%置信區(qū)間。并依據(jù)特倫堡（Turubell）的安全濃度計算公式：48 h LC50×0.3/（24 h LC50/48 h LC50）2得出安全濃度（Safe concentration，SC）［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-甲-4-氯鈉對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的2-甲-4-氯鈉處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 50.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，而質(zhì)量濃度為 150.0 μg·cm-2，其死亡率超過 50%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 50.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率為 10%，而質(zhì)量濃度為 250.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到100%。且2-甲-4-氯鈉對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 8種常見農(nóng)藥處理赤子愛勝蚓的死亡率Table 2 The death rates of the Eisenia foetida treated with eight commonly used pesticides,respectively

2-甲-4-氯鈉對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，由表3、表4可知，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出2-甲-4-氯鈉對赤子愛勝蚓的24 h和48 h LC50數(shù)值分別為149.6 μg·cm-2和128.5 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 28.4 μg·cm-2。

2.2 農(nóng)用硫酸鏈毒素對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的農(nóng)用硫酸鏈毒素處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 500.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，質(zhì)量濃度為 800.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到 30%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為600.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率超過50%。且農(nóng)用硫酸鏈毒素對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

農(nóng)用硫酸鏈毒素對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，由表3、表4可知，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出農(nóng)用硫酸鏈毒素對赤子愛勝蚓的24 h和48 h LC50數(shù)值分別為 882.3 μg·cm-2和595.7 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 81.5 μg·cm-2。

表3 8種常見農(nóng)藥對赤子愛勝蚓的24 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析Table 3 The regression analysis of the acute toxic effects of eight commonly used pesticides on Eisenia foetida within 24 h

2.3 福美雙對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的福美雙處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為300.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，質(zhì)量濃度為 600.0 μg·cm-2，其死亡率依舊小于 50%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 200.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率為 23.3%，而質(zhì)量濃度為 400.0 μg·cm-2，其死亡率超過50%。且福美雙對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

福美雙對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，由表3、表4可知，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出福美雙對赤子愛勝蚓的 24 h 和 48 h LC50數(shù)值分別為 723.5 μg·cm-2和 353.3 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 25.3 μg·cm-2。

2.4 滅蠅胺對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的滅蠅胺處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為600.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，質(zhì)量濃度為 900.0 μg·cm-2，其死亡率依舊小于 50%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 700.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率超過 50%，而質(zhì)量濃度為 900.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到96.7%。且滅蠅胺對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表4 8種常見農(nóng)藥對赤子愛勝蚓的48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析Table 4 The regression analysis of the acute toxic effects of eight commonly used pesticides on Eisenia foetida within 48 h

滅蠅胺對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，由表3、表4可知，通過回歸分析，在24 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間呈現(xiàn)顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），而在48 h內(nèi)赤子愛勝蚓的農(nóng)藥濃度與死亡率之間呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出滅蠅胺對赤子愛勝蚓的 24 h 和 48 h LC50數(shù)值分別為 1015.4 μg·cm-2和 657.8 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 82.8 μg·cm-2。

2.5 唑醚·代森聯(lián)對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的唑醚·代森聯(lián)處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 33.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，而質(zhì)量濃度為 66.0 μg·cm-2，其死亡率接近 50%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 33.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率為 16.7%，而質(zhì)量濃度為 66.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到53.3%。且唑醚·代森聯(lián)對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

唑醚·代森聯(lián)對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，由表3、表4可知，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出唑醚·代森聯(lián)對赤子愛勝蚓的 24 h 和 48 h LC50數(shù)值分別為 64.1 μg·cm-2和 59.9 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 15.7 μg·cm-2。

2.6 苯醚甲環(huán)唑?qū)Τ嘧訍蹌衮镜募毙远拘孕?yīng)

不同濃度的苯醚甲環(huán)唑處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 100.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，質(zhì)量濃度為 300.0 μg·cm-2，其死亡率為 23.3%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 250.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率超過 50%，而質(zhì)量濃度為 300.0 μg·cm-2，其死亡率為80%。且苯醚甲環(huán)唑?qū)Τ嘧訍蹌衮镜钠骄劳雎孰S著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

苯醚甲環(huán)唑?qū)Τ嘧訍蹌衮镜?4 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，由表3、表4可知，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出苯醚甲環(huán)唑?qū)Τ嘧訍蹌衮镜?24 h 和 48 h LC50 數(shù)值分別為 382.7 μg·cm-2和 222.4 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 22.5 μg·cm-2。

2.7 噁霉靈對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的噁霉靈處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，由表2可知，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為100.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓沒有出現(xiàn)死亡，而質(zhì)量濃度為 190.0 μg·cm-2，其死亡率超過 50%；48 h 觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 100.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率為 6.7%，而質(zhì)量濃度為 220.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到100%。且噁霉靈對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

噁霉靈對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出噁霉靈對赤子愛勝蚓的24h和48hLC50數(shù)值分別為185.7 μg·cm-2和148.0μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為28.2μg·cm-2。

2.8 烯酰嗎啉對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

不同濃度的烯酰嗎啉處理赤子愛勝蚓的累計死亡率見表2，24 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為100.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到3.3%，而質(zhì)量濃度為700.0 μg·cm-2，其死亡率依舊小于50%；48 h觀察時，當(dāng)質(zhì)量濃度為 100.0 μg·cm-2，赤子愛勝蚓的死亡率為 6.7%，而質(zhì)量濃度為 700.0 μg·cm-2，其死亡率達(dá)到 96.7%。且烯酰嗎啉對赤子愛勝蚓的平均死亡率隨著農(nóng)藥濃度的升高和暴露時間的延長而增加，因此該農(nóng)藥對蚯蚓的毒性存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

烯酰嗎啉對赤子愛勝蚓的24 h和48 h急性毒性效應(yīng)的回歸分析見表3、表4，通過回歸分析，在24 h和48 h內(nèi)農(nóng)藥濃度與赤子愛勝蚓的死亡率之間均呈現(xiàn)極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。得出烯酰嗎啉對赤子愛勝蚓的24 h和48 h LC50數(shù)值分別為808.7 μg·cm-2和452.2 μg·cm-2。通過計算可知其安全濃度（SC）為 42.4 μg·cm-2。

3 討論

快速地判斷農(nóng)藥對環(huán)境的生態(tài)毒性的測定方法，常用赤子愛勝蚓開展急性毒性試驗(yàn)，以探明農(nóng)藥在短時間接觸蚯蚓后所所產(chǎn)生的致死效應(yīng)。因此，急性毒性試驗(yàn)在農(nóng)藥的生態(tài)毒理學(xué)研究中具有比較重要的作用［9-10］。有關(guān)蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)方法，國內(nèi)外常用標(biāo)準(zhǔn)濾紙法、注射法、自然土壤法、人工土壤法、飼喂法、浸入法、強(qiáng)迫攝食法和點(diǎn)滴法等［11-13］。但由于標(biāo)準(zhǔn)濾紙法重復(fù)性較好、簡單和快速，能夠較好地反映農(nóng)藥的固有毒性和對土壤生態(tài)系統(tǒng)的潛在毒性，從而更好地研究農(nóng)藥對環(huán)境的影響［14］。

本次實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)濾紙法來探究赤子愛勝蚓急性毒性效應(yīng)也存在一定的不足，比如實(shí)驗(yàn)過程中，由于農(nóng)藥粘附于濾紙表面，蚯蚓體表直接與藥劑接觸，吸收量大、吸收速率快，這使得實(shí)驗(yàn)當(dāng)中所得到的毒性效應(yīng)比真實(shí)土壤中相對較高。8種農(nóng)藥對赤子愛勝蚓均具有一定的急性毒性效應(yīng)，其毒性大小序列為唑醚·代森聯(lián)＞2-甲-4-氯鈉＞噁霉靈＞苯醚甲環(huán)唑＞福美雙＞烯酰嗎啉＞農(nóng)用硫酸鏈霉素＞滅蠅胺。容易發(fā)現(xiàn)各農(nóng)藥間毒性差異較大，原因可能是因?yàn)檗r(nóng)藥的作用機(jī)制、化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物可利用性不同，從而導(dǎo)致蚯蚓吸收機(jī)制不同，因此標(biāo)準(zhǔn)濾紙法測定的毒理數(shù)據(jù)在制定土壤生態(tài)篩選基準(zhǔn)上的作用是有限的。

目前針對農(nóng)藥的亞致死效應(yīng)如對蚯蚓的行為、生長、繁殖和組織結(jié)構(gòu)等的影響，以及更接近于實(shí)際生態(tài)系統(tǒng)中的低劑量農(nóng)藥對蚯蚓的長期毒性效應(yīng)等方面的研究較少。因此，應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)藥對蚯蚓的亞致死效應(yīng)和分子毒理學(xué)研究，為全面評價農(nóng)藥對環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。