黃思瑜 董憲兵 鄧宇杰 普正佳 田 圓 汪 敏

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 重慶 401121）

1 前言

烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要有毒成份[1-4]。它們主要毒性作用是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟，據(jù)估計(jì)，口服烏頭堿 2～3 mg 就可致人死亡[5]。但川烏、草烏、附子是中醫(yī)臨床常用中藥，民間常用草烏、川烏等植物來泡制藥酒，治療關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病等。但如果使用未炮制的烏頭堿類藥材、烏頭堿類藥材自行泡制藥酒，常導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生[6]。因此，建立藥酒中烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿的檢測方法對藥酒的安全性評價具有重要意義。烏頭堿類藥物常用的檢測方法有雙光束紫外-可見分光光度計(jì)[7-9]、薄層色譜法[10-13]、高效液相色譜法[14,15]、毛細(xì)管電泳場技術(shù)[16,17]、液相色譜-質(zhì)譜法等[18-20]。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對藥酒中烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿的分離和分析方法進(jìn)行了研究，建立了定量及定性同時開展的快速方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

美國Waters 公司 Acquity UPLC 超高效液相色譜儀；美國AB SCIEX 公司API4000 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；乙酸銨（色譜純，美國天地試劑公司）；次烏頭堿、烏頭堿、中烏頭堿均購于中國藥品生物制品檢定所。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量次烏頭堿、烏頭堿、中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品適量于100 mL 容量瓶，用乙腈溶解，并定容至刻度。配制成濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18℃避光保存。準(zhǔn)確移取次烏頭堿、烏頭堿、中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL 至100 mL 容量瓶，用乙腈稀釋定容，得到10 μg/mL 的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存。用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到 10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L濃度系列。

2.3 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫:40℃；流速:0.3 mL/min；進(jìn)樣量:5 μL。流動相:乙腈:10 mmol/L 乙酸銨水溶液（氨水調(diào)節(jié) pH9.5）=50：50（V/V）。

2.4 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源；掃描方式:正離子掃描；檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM；噴霧電壓:5 500 V，離子源溫度:550℃；監(jiān)測離子對:次烏頭堿616.4/524.4、616.4/556.3，烏頭堿 646.3/586.3、646.3/368.3，中烏頭堿 632.3/354.3、632.3/572.4。

2.5 樣品處理

取1mL 樣品過0.22μm 尼龍微孔濾膜，上機(jī)測定。

3 結(jié)果

3.1 方法的線性范圍和定量限

在設(shè)定色譜、質(zhì)譜條件下，用空白基質(zhì)配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對應(yīng)相應(yīng)濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量，計(jì)算回歸方程。從表1可以看出，次烏頭堿、烏頭堿及中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度與色譜峰面積在0～1 000 μg/L 呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）在 0.999 以上。用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，按照信噪比S/N（S 為電子系統(tǒng)中的信號；N 為電子系統(tǒng)中的噪聲）=3 計(jì)算次烏頭堿、烏頭堿及中烏頭堿的檢出限（LOD值），S/N=10 計(jì)算定量限。

表1 次烏頭堿、烏頭堿及中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系和檢出限

3.2 準(zhǔn)確度與精密度

在空白樣品中加入適量混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)量為 1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L，按照前述樣品處理方法進(jìn)行測定，每個添加水平測定6 次，加標(biāo)回收率為94%，95%和100%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.50%，2.44%和0.55%。

3.3 流動相的選擇

由于烏頭類生物堿對pH 較敏感，考察了流動相pH 值對3 種化合物分離度的影響。烏頭堿類化合物為生物堿類化合物，在堿性條件下分離更好，因此比較了流動相 pH=7、pH=8、pH=9.5 條件下的分離和保留情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH=9.5 的情況下分離最好，3 種化合物離子色譜圖詳見圖1。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液基質(zhì)的選擇

由于酒中含有乙醇，進(jìn)行質(zhì)譜測定時，可能會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。比較水溶液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線與空白基質(zhì)溶液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)溶液對響應(yīng)值有一定的抑制作用，因此，選用空白基質(zhì)溶液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.5 實(shí)際樣品分析

用本方法對重慶城區(qū)餐飲自制藥酒共35 份樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，有5 份樣品檢出烏頭類生物堿，檢出率為14.2%。其中，烏頭堿均未檢出，次烏頭堿有2 份樣品有檢出，中烏頭堿有3 份樣品有檢出，檢出值均小于 10 μg/L。

圖1 MRM 模式下標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖

4 結(jié)語

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對藥酒中烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿的分離和分析方法進(jìn)行了研究，建立了定量及定性方法。本方法操作簡單、定性、定量準(zhǔn)確，可以用于藥酒中烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿的檢測。