基于雙重猝滅分子信標(biāo)及核酸染料Hoechst 33258對單鏈核酸的雙色定量檢測

魯子敬 熊威威 翟琨 向東山 譚志斗

摘?要?利用鳥嘌呤（G）堿基和有機(jī)猝滅基團(tuán)Black Hole Quencher 1 （BHQ-1）對熒光基團(tuán)6-羧基熒光素（6-Carboxyfluorescein group，F(xiàn)AM）的雙重猝滅作用構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)簡單的雙重猝滅分子信標(biāo)，結(jié)合核酸染料Hoechst 33258，以艾滋病毒RNA片段的反轉(zhuǎn)錄序列（33個堿基）為目標(biāo)DNA，建立了一種高靈敏單鏈核酸（ssDNA）的雙色熒光定量檢測方法。此分子信標(biāo)中，熒光基團(tuán)及有機(jī)猝滅基團(tuán)分別設(shè)計(jì)為FAM和BHQ-1，分子信標(biāo)的莖的堿基全部設(shè)計(jì)為C-G堿基對，環(huán)的堿基序列設(shè)計(jì)為目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序列，與BHQ-1相連接的為3個帶有G堿基的核苷酸。沒有目標(biāo)DNA時，分子信標(biāo)呈莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)FAM與有機(jī)猝滅基團(tuán)BHQ-1及G堿基距離很近，在BHQ-1及G堿基的雙重猝滅下，F(xiàn)AM的熒光很弱;另外，分子信標(biāo)的莖的堿基全部是C-G堿基對，不能與核酸染料Hoechst 33258相結(jié)合，因此Hoechst 33258的熒光也很弱。當(dāng)有目標(biāo)DNA存在時，分子信標(biāo)的環(huán)與目標(biāo)DNA雜交形成雙鏈，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)AM遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)BHQ-1及G堿基，其熒光得到恢復(fù); 同時，核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA中的A-T堿基對相結(jié)合，其熒光顯著增強(qiáng)。根據(jù)熒光基團(tuán)FAM及核酸染料Hoechst 33258熒光增強(qiáng)的程度可實(shí)現(xiàn)對ssDNA的定量檢測。在優(yōu)化的條件下，目標(biāo)DNA的濃度在0.05～8.0 nmol/L范圍內(nèi)時，F(xiàn)AM和Hoechst 33258的總熒光強(qiáng)度（ΔIT）與目標(biāo)DNA的濃度（C）具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔIT=192.2C + 115.08 （R2=0.9938），檢出限為20 pmol/L （3σ， n=9）。此方法操作簡單、靈敏度高、選擇性好、檢出限低。

關(guān)鍵詞?雙重猝滅分子信標(biāo); 單鏈核酸; Hoechst 33258; 雙色熒光; 定量檢測

1?引 言

單鏈核酸的檢測在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子醫(yī)學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域都具有十分重要的意義[1～5]。分子信標(biāo)（Molecular beacons）是一種具有高選擇性的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、藥物分子及金屬離子的分析與檢測，尤其是單鏈核酸的檢測中[6，7]。Hoechst 33258是一種高靈敏的染料，在水溶液或單鏈DNA溶液中熒光很弱，但與含A-T堿基對的雙鏈DNA具有很強(qiáng)的親和作用，且與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光強(qiáng)度會顯著增加[8～11]。

傳統(tǒng)的分子信標(biāo)在檢測DNA時，與某些熒光染料相比，其靈敏度相對較差[12，13];此外，傳統(tǒng)的分子信標(biāo)中有機(jī)猝滅基團(tuán)對熒光基團(tuán)的猝滅效果不是很好，背景信號偏高，影響方法靈敏度[14，15]。

為降低傳統(tǒng)分子信標(biāo)的背景熒光，許多研究者對分子信標(biāo)的有機(jī)猝滅基團(tuán)進(jìn)行了改進(jìn)，如Adegoke等[14]用納米金替代分子信標(biāo)的有機(jī)猝滅基團(tuán)，Oh等[15]利用氧化石墨烯替代分子信標(biāo)中的猝滅基團(tuán)。這些改進(jìn)都極大地降低了分子信標(biāo)的背景，但這類分子信標(biāo)制備過程復(fù)雜，成本高。為提高分子信標(biāo)檢測的靈敏度，本研究組在利用分子信標(biāo)進(jìn)行檢測時引入了熒光染料 [12，13，16]，顯著提高了檢測的靈敏度，但也導(dǎo)致了熒光背景增加， 如利用分子信標(biāo)及熒光染料SYBR GreenⅠ建立了一種雙色熒光定量檢測DNA的方法[13]，引入熒光染料SYBR GreenⅠ，顯著提高了檢測的靈敏度，但熒光染料SYBR GreenⅠ能與分子信標(biāo)莖的堿基發(fā)生作用，與雙鏈作用無選擇性，導(dǎo)致熒光背景信號增加[17]。

本研究利用鳥嘌呤（G）堿基和有機(jī)猝滅基團(tuán)BHQ-1對熒光基團(tuán)FAM的雙重猝滅作用，設(shè)計(jì)了一種分子信標(biāo)，并結(jié)合核酸染料Hoechst 33258，建立了一種單鏈核酸的高靈敏雙色熒光定量檢測方法。在此方法中，引入的核酸染料Hoechst 33258可以和分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交后形成的雙鏈DNA作用，使熒光信號顯著增強(qiáng)，因此可顯著提高檢測的靈敏度。另外，本研究對分子信標(biāo)進(jìn)行了兩方面改進(jìn)，一是利用G堿基和有機(jī)猝滅基團(tuán)對熒光基團(tuán)進(jìn)行雙重猝滅，使分子信標(biāo)本身的熒光背景信號顯著下降[18];二是分子信標(biāo)的莖的堿基全部設(shè)計(jì)為C-G堿基對，核酸染料Hoechst 33258不能與之結(jié)合，因此引入的熒光染料幾乎沒有熒光背景信號，從而降低檢出限，顯著提高了檢測靈敏度。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

RF-5301PC型熒光光譜儀（日本Shimadzu公司）。

Hoechst 33258購于北京泛博生物化學(xué)有限公司;其它試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用緩沖溶液為0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液;分子信標(biāo)和所有的寡核苷酸序列均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

2.2?樣品的制備

首先，將分子信標(biāo)用 0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH 8.0）配制成80 nmol/L儲備液，再將目標(biāo)DNA配制成不同濃度的溶液。將50 μL不同濃度的目標(biāo)DNA加入到50 μL 80 nmol/L分子信標(biāo)溶液中，混合均勻，在50℃水浴中加熱5 min，冷卻至室溫后，加入Tris-HCl緩沖溶液至終體積為 450 μL，加入50 μL 2 μmol/L Hoechst 33258，在室溫下反應(yīng)8 min，檢測體系的FAM及Hoechst 33258的熒光信號。在方法靈敏度的考察實(shí)驗(yàn)中，首先將不同的目標(biāo)DNA用0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH 8.0）配制成60 nmol/L的儲備液，再分別取50 μL目標(biāo)DNA及互補(bǔ)DNA混合均勻，室溫下反應(yīng)5 min，加入50 μL 2 μmol/L Hoechst 33258，在室溫下反應(yīng)8 min，檢測Hoechst 33258的熒光信號。

2.3?目標(biāo)DNA的檢測

通過檢測反應(yīng)后體系中FAM及Hoechst 33258的熒光信號實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的檢測。對FAM熒光的檢測采用同步熒光分析法，同步掃描的波長間隔（Δλ）為26 nm，最大發(fā)射波長為526 nm。檢測Hoechst 33258的熒光信號時，最大激發(fā)波長為346 nm，最大發(fā)射波長為463 nm，激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。 檢測波長均為FAM及Hoechst 33258的最大發(fā)射波長。

2.4?方法選擇性考察

50 μL 80 nmol/L目標(biāo)DNA序列和相同濃度的堿基錯配序列均按2.2節(jié)的方法進(jìn)行配制，分別檢測體系中FAM及Hoechst 33258的熒光信號，最后對總的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較和分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?檢測原理

利用雙重猝滅分子信標(biāo)及Hoechst 33258檢測DNA的原理如圖1所示。雙重猝滅分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)設(shè)計(jì)為FAM，猝滅基團(tuán)為BHQ-1，分子信標(biāo)的莖由8對核苷酸組成，堿基組成全部為C-G堿基對，與BHQ-1相連接的為3個帶有G堿基的核苷酸，分子信標(biāo)的環(huán)由33個核苷酸組成，其堿基序列為目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序列。沒有目標(biāo)DNA時，分子信標(biāo)呈莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)FAM與有機(jī)猝滅基團(tuán)BHQ-1及G堿基相互靠近，在BHQ-1及G堿基的雙重猝滅下，F(xiàn)AM的熒光信號很弱;此外，分子信標(biāo)的莖的堿基全部設(shè)計(jì)為C-G堿基對，不能與核酸染料Hoechst 33258相結(jié)合，因此Hoechst 33258的熒光也很弱。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時，分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交形成雙鏈DNA，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)AM遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)BHQ-1及G堿基，其熒光得到恢復(fù);同時，核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA中的A-T堿基對相結(jié)合，其熒光信號也顯著增強(qiáng)。根據(jù)熒光基團(tuán)FAM及核酸染料Hoechst 33258熒光增強(qiáng)的程度即可實(shí)現(xiàn)對單鏈核酸的雙色定量檢測。

3.2?可行性分析

圖2為不同濃度的目標(biāo)DNA與相同濃度的分子信標(biāo)和Hoechst 33258作用后，F(xiàn)AM和Hoechst 33258所對應(yīng)的熒光光譜圖。在沒有目標(biāo)DNA存在時，F(xiàn)AM和Hoechst 33258的熒光信號都很弱（圖2A-a，圖2B-a）;目標(biāo)DNA存在時，F(xiàn)AM和Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度都顯著增加，且DNA濃度越高時，F(xiàn)AM和Hoechst 33258熒光增強(qiáng)程度越大（圖2A-b，c，圖2B-b，c）。另外，當(dāng)目標(biāo)DNA存在時，分子信標(biāo)打開，此時其兩端的熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQ-1距離嵌入雙鏈DNA的Hoechst 33258分子都很近。Hoechst 33258與FAM之間可能存在熒光共能量轉(zhuǎn)移，猝滅基團(tuán)BHQ-1也可能對Hoechst 33258的熒光有一定的猝滅作用。從圖2B可見，采用346 nm激發(fā)光時，未觀察到FAM的熒光峰，說明在Hoechst 33258與FAM之間不存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移;Hoechst 33258的最大發(fā)射波長（本實(shí)驗(yàn)的檢測波長）為463 nm，而猝滅基團(tuán)BHQ-1的猝滅范圍在480～580 nm之間，BHQ-1不會對Hoechst 33258檢測波長處的熒光有猝滅作用。因此，利用本方法對目標(biāo)DNA的雙色定量檢測是可行的。

3.3?實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.3.1?Hoechst 33258濃度的選擇?核酸染料Hoechst 33258和與含A-T堿基對的雙鏈DNA結(jié)合后才會產(chǎn)生熒光，在分析體系中通常采用相對過量的Hoechst 33258，以保證可與所有雜交形成的雙鏈DNA結(jié)合，但濃度過大又會產(chǎn)生背景信號。實(shí)驗(yàn)表明，在分子信標(biāo)及目標(biāo)DNA濃度均為8 nmol/L時，Hoechst 33258的濃度在0～100 nmol/L范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度隨濃度的增加而增大;當(dāng)Hoechst 33258濃度超過100 nmol/L后，其熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化。為了保證分析體系中Hoechst 33258相對過量，本實(shí)驗(yàn)選擇其濃度為200 nmol/L。

3.3.2?pH值對檢測的影響?緩沖體系的pH值不僅可以影響分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的雜交效果，還可能直接影響熒光染料的發(fā)光強(qiáng)度。在pH<8.0時，F(xiàn)AM與Hoechst 33258的總熒光強(qiáng)度隨著pH值的增大而增大，在pH=8.0時達(dá)到最大，說明目標(biāo)DNA的檢測在略偏堿性的緩沖溶液中效果較好。因此選擇pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液。

3.3.3?Hoechst 33258與雙鏈DNA作用時間的影響?Hoechst 33258只有與雙鏈DNA中的A-T堿基對結(jié)合后才會發(fā)出較強(qiáng)的熒光。對Hoechst 33258與雙鏈DNA的結(jié)合時間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，結(jié)合時間小于8 min時，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度隨著時間的延長而增加;當(dāng)結(jié)合時間超過8 min后，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度幾乎不再發(fā)生變化，說明Hoechst 33258與雙鏈DNA的結(jié)合在8 min內(nèi)已完成。因此， Hoechst 33258與雙鏈DNA的結(jié)合時間選擇為8 min。

3.3.4?目標(biāo)DNA中A-T堿基的數(shù)量對方法靈敏度的影響?Hoechst 33258只與雙鏈DNA中的A-T堿基對作用，因此目標(biāo)DNA中A-T堿基的數(shù)量直接影響染料Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度，從而影響方法的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)所使用的分子信標(biāo)環(huán)的堿基總數(shù)為33個，與目標(biāo)DNA反應(yīng)后形成的雙鏈DNA中共有33對堿基。因此設(shè)計(jì)了5種總堿基數(shù)均為33個，含A-T堿基的數(shù)量分別為0、7、14、21和28個的DNA（表1），對單鏈DNA中A-T堿基的數(shù)量與Hoechst 33258熒光強(qiáng)度的關(guān)系進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，單鏈DNA中A-T堿基的數(shù)量越多，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度越大，即目標(biāo)DNA中A-T堿基的數(shù)量越多，方法的靈敏度也越高。

3.4?方法的分析性能

在優(yōu)化的條件下，檢測不同濃度目標(biāo)DNA存在下的FAM和 Hoechst 33258熒光強(qiáng)度（圖3及圖4）。結(jié)果表明，目標(biāo)DNA的濃度在0.05～8.0 nmol/L范圍內(nèi)，F(xiàn)AM和 Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度（ΔI，ΔI=I-I0， I0表示沒有目標(biāo)DNA的熒光強(qiáng)度，I表示有目標(biāo)DNA的熒光強(qiáng)度）與目標(biāo)DNA的濃度（C）均呈良好的線性關(guān)系（圖4A和4B），回歸方程分別為ΔI1=84.9+C + 6.83 （R2=0.9928）， ΔI2=109.9C + 69.11（R2=0.9981）。另外，F(xiàn)AM和 Hoechst 33258總的熒光強(qiáng)度（ΔIT， FAM在525 nm處的熒光強(qiáng)度與Hoechst 33258在463 nm處的熒光強(qiáng)度之和）與目標(biāo)DNA的濃度（C）也具有良好的線性關(guān)系（圖4C），線性方程為ΔIT=192.2C + 115.08 （R2=0.9938），檢出限為20 pmol/L （3σ， n=9）。上述結(jié)果表明，利用FAM和 Hoechst 33258總的熒光強(qiáng)度對目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測時，工作曲線的斜率均大于利用FAM或 Hoechst 33258單獨(dú)的熒光強(qiáng)度對目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測時的斜率，靈敏度更高。對9個相同濃度的目標(biāo)DNA（500 pmol/L）進(jìn)行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 2.3%，精密度良好。與其它已報(bào)道的利用分子信標(biāo)對單鏈DNA的檢測方法相比（表2），本方法的靈敏度更高，檢出限更低。

3.5?方法的選擇性

采用本方法檢測了濃度均為8 nmol/L的目標(biāo)DNA、單堿基錯配的DNA、雙堿基錯配的DNA及三堿基錯配的DNA（圖5）。結(jié)果表明，單堿基錯配的DNA、雙堿基錯配的DNA及三堿基錯配的DNA所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度（ΔIT）都遠(yuǎn)低于目標(biāo)DNA所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，表明本方法具有良好的選擇性。

3.6?實(shí)際樣品中目標(biāo)DNA的檢測

將兩個相同濃度的目標(biāo) DNA分別用緩沖溶液和人血清稀釋至800 pmol/L，并分別用緩沖溶液和人血清做空白實(shí)驗(yàn)，扣除空白值（背景熒光）后，兩者總的熒光強(qiáng)度（ΔIT，F(xiàn)AM與Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度之和）基本一致，表明本方法具有良好的實(shí)用性，可用于復(fù)雜樣品的分析。

4?結(jié) 論

利用G堿基和有機(jī)猝滅基團(tuán)BHQ-1對熒光基團(tuán)FAM的雙重猝滅作用構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)簡單的雙重猝滅分子信標(biāo)，結(jié)合核酸染料Hoechst 33258，建立了高靈敏的雙色熒光定量檢測單鏈核酸的方法。本方法降低了熒光背景信號，從而降低了方法的檢出限，顯著提高了檢測靈敏度。

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