液相色譜-高分辨質(zhì)譜結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子

常晉霞 汪宜 張帆 劉文虎

摘?要?采用基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列串聯(lián)多拷貝雙聯(lián)DNA結(jié)合元件（Concatenated tandem array of transcription factor response elements， catTFRE） Pull down蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究了曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控作用。以合成的串聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列DNA片段為親和試劑，用生物素標(biāo)記，作為“DNA誘餌”，通過Pull down富集后，采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測捕獲的轉(zhuǎn)錄因子，基于強度定量法（Intensity based absolute quantification， iBAQ）定量，篩選出與DNA結(jié)合活性顯著變化的轉(zhuǎn)錄因子。利用WebGestalt （2017）數(shù)據(jù)庫對激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號通路、家族分類、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及轉(zhuǎn)錄因子-靶基因（TFs-targets）進行分析。結(jié)果表明， 359個轉(zhuǎn)錄因子被定量檢測，與親本細(xì)胞相比，61個轉(zhuǎn)錄因子在曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞中與DNA結(jié)合活性顯著變化，其中結(jié)合活性增強48個，活性降低13個。激活轉(zhuǎn)錄因子屬于bZIP、bHLH、homebox、HMG box、Zine finger等家族。KEGG通路富集顯示，癌癥、MAPK、Wnt、TGF-β、凋亡等多條通路在耐藥細(xì)胞中顯著改變。TFs-targets分析表明，TCF7L2、TCF7、FOXC1、JUN、CYC、FOS、ELK4、NFκB2、DDIT3和ATF2在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transformation， EMT）、Wnt、MAPK信號通路促使胃癌曲妥珠單抗耐藥過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，提示靶向這些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的信號通路可能是逆轉(zhuǎn)胃癌曲妥珠單抗耐藥的重要途徑。

關(guān)鍵詞?曲妥珠單抗; 耐藥性; 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列串聯(lián)多拷貝雙聯(lián)DNA結(jié)合元件; Pull down; 蛋白質(zhì)組學(xué)

1?引 言

胃癌的發(fā)病率、死亡率在所有惡性腫瘤中位居前列，由于缺乏早期診斷手段，超過70%的患者確診時已有轉(zhuǎn)移或進入中晚期[1]。曲妥珠單抗為靶向HER-2的單克隆抗體藥物，通過拮抗HER-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用發(fā)揮作用，用于HER-2過表達轉(zhuǎn)移性乳腺癌和胃癌的治療[2]。盡管曲妥珠單抗療效確切，然而腫瘤獲得性耐藥已成為影響其有效治療的重要問題[3]。因此，研究胃癌曲妥珠單抗耐藥機制，對闡明逆轉(zhuǎn)耐藥機理，增強腫瘤化療敏感性具有重要意義。

近年來，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)高通量分析方法得到快速發(fā)展，為闡明疾病的發(fā)病機理提供了技術(shù)條件[4～6]。轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控基因表達的蛋白質(zhì)，在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥過程中發(fā)揮著重要作用[7]。對轉(zhuǎn)錄因子的定量分析研究是闡明其生物功能、揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的首要條件，然而由于轉(zhuǎn)錄因子的豐度極低，因此給其檢測和定量帶來了極大困難。盡管mRNA測序、染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測序（ChIP-Seq）等技術(shù)被用于轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平的定量及轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的動態(tài)研究，然而由于mRNA與蛋白質(zhì)表達的相關(guān)性僅30%，因此以mRNA推測轉(zhuǎn)錄因子的表達的準(zhǔn)確性并不高[8]; 而ChIP-Seq對抗體的特異性要求高，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[9]。Ding等[10]開發(fā)了一種深度檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合活性的技術(shù)，合成了包含100種不同類型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的串聯(lián)多拷貝DNA結(jié)合元件，用生物素標(biāo)記后包裝成“DNA誘餌”，采用Pull down策略富集核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，利用蛋白/肽段分級分離聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對捕獲的轉(zhuǎn)錄因子進行深度分析，解決了轉(zhuǎn)錄因子定量檢測的難題，為低豐度蛋白質(zhì)的定量分析提供了新策略。

在本研究組的前期研究中[11，12]，基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達譜，發(fā)現(xiàn)多條信號通路激活與耐藥相關(guān)，在此基礎(chǔ)上探究了逆轉(zhuǎn)胃癌曲妥珠單抗耐藥的可能策略[13]。本研究以曲妥珠單抗敏感細(xì)胞NCI N87和耐藥細(xì)胞NCI N87/R為研究對象，利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合catTFRE pull down策略，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度探究曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞NCI N87/R的轉(zhuǎn)錄因子，通過生物信息學(xué)手段對激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號通路、作用網(wǎng)絡(luò)、家族分類及轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控關(guān)系進行分析，為胃癌曲妥珠單抗耐藥機制研究提供了科學(xué)依據(jù)。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Q-Exactive Plus質(zhì)譜儀和Easy-nLC 1000 nano液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）; VCX500型SONICS多功能超聲儀（美國Sonics公司）; HS-3垂直混合儀（寧波新芝生物公司）; GL-802B微型真空泵（海門其林貝爾儀器公司）; 5810R型真空濃縮儀（德國Eppendorf公司）; DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器公司）; CKX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）; LRH-70生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）。

NCI N87和NCI N87/R細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院施明教授惠贈。注射用曲妥珠單抗（上海羅氏制藥有限公司，規(guī)格440 mg，批號S20060026）; 胎牛血清（FBS， 美國Gibco公司）; DMEM培養(yǎng)基和胰酶（美國Mediatech公司）; 雙抗（含100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，北京鈕英泰克生物技術(shù)有限公司）; pGEX4T2-catTFRE重組質(zhì)粒（上海Sigma公司合成）; Biotin標(biāo)記的catTFRE引物（華大基因合成，引物5′用biotin標(biāo)記，正向引物：5′-CCCAGTCACGTAGCGATAGC-3′，反向引物：3′-CGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG-5′）; DNA聚合酶、DNA Ladder、DL2000 DNA ladder（日本TakaRa公司）; Pure Plasmid Mini Kit、Gel extraction kit、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（北京康為世紀(jì)生物有限公司）; NE-PER核蛋白提取試劑盒、DynabeadsTM M-280 Streptavidin親和磁珠（美國Thermo Fisher公司）; 胰酶（美國Promega公司）; 抗體c-Jun（9165）、JunB （3753）、c-Myc（5605）和GAPDH（5174） （美國Cell Signaling Technology公司）; NaHCO3、NaOH（分析純，美國Sigma公司）; 甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、純水（HPLC級，美國Thermo Fisher公司）; NETN、BC-0、2×DNA Binding Buffer、1×DNA Binding Buffer、BC-150、BC-200、50×TAE和Destain脫色液（自制）。

2.2?實驗方法

2.2.1?細(xì)胞培養(yǎng)?親代細(xì)胞NCI N87和耐藥細(xì)胞NCI N87/R采用DMEM （加10% FBS和1%雙抗）培養(yǎng)基， 在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳代2～3次后進行實驗。為保持耐藥性質(zhì)，NCI N87/R細(xì)胞培養(yǎng)過程需加入一定量的曲妥珠單抗，終濃度為40 μg/mL。

2.2.2?重組質(zhì)粒pGEX4T2-catTFRE的提取?catTFRE序列根據(jù)高等脊椎動物轉(zhuǎn)錄因子庫設(shè)計（http：//jaspar.genereg.net/），將其鏈接到pGEX4T2載體上，得到全長為2.8 kb的重組質(zhì)粒。將1 μL pGEX4T2-catTFRE質(zhì)粒加入到50 μL TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)熱激、復(fù)蘇后涂布于氨芐抗性Luria-Bertani平板，37℃培養(yǎng)過夜，取單菌落接種于2 mL Luria-Bertani培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h，按1∶100接種至50 mL培養(yǎng)基， 培養(yǎng)18 h，按試劑盒說明提取質(zhì)粒。

2.2.3?Biotin標(biāo)記catTFRE DNA擴增?引物序列見2.1節(jié)，PCR反應(yīng)體系及條件詳見文獻[8]。DNA序列見電子版文后支持信息。

2.2.4?Biotin標(biāo)記catTFRE DNA的純化與回收?catTFRE DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，使用DNA凝膠試劑盒回收、純化，測定濃度后分裝，20℃保存，備用。

2.2.5?核蛋白提取[10] 收集對數(shù)期生長的細(xì)胞，用預(yù)冷PBS清洗2次，重懸，800 r/min離心5 min，棄上清液。利用NE-PER試劑盒提取核蛋白，加入CERI和蛋白酶抑制劑，振蕩，冰上裂解15 min。加入適量CERII，振蕩10 s，冰上裂解30 s，4℃、16000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入NER重懸，振蕩20 s，4℃垂直混勻儀孵育1 h。4℃、16000 r/min離心20 min，將核蛋白提取物轉(zhuǎn)移于EP管中，用Bradford法測定蛋白濃度。

2.2.6?catTFRE pull down[10] 取DynabeadsTM M-280 Streptavidin適量于EP管中，加入300 μL1×DNA結(jié)合緩沖液清洗M-280，加入計算量的catTFRE DNA（120 μL M-280結(jié)合3 pmol/L catTFRE DNA），再加入等量2×DNA結(jié)合緩沖液，4℃垂直混勻儀孵育20 min。用200 μL BC-200清洗M-280，加入核蛋白，用BC-0調(diào)整鹽濃度至200 mmol/L，4℃孵育2 h，分別用50 mmol/L NETN和PBS清洗M-280。

2.2.7?SDS-PAGE凝膠電泳?樣品中加入20 μL上樣緩沖液，混勻，95℃金屬浴煮5 min，取上清液，進行SDS-PAGE電泳[10]，待Marker進入分離膠約2.0 cm停止電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色。將膠條自下而上橫切成6等份，分別置于EP管中，加入500 μL Destain脫色液，振蕩至完全脫色，加入200 μL 75%乙腈，振蕩30 min，吸去脫色液; 加入質(zhì)譜水500 μL，振蕩水化1 h，加入50 mmol/L NH4HCO3 300 μL，振蕩5 min，吸去上清液，加入100 ng/μL胰酶-50 mmol/L NH4HCO3（1∶10，V/V）溶液，搗碎膠條，37℃孵育過夜，肽段消化后用200 μL乙腈萃取2次，合并萃取液，12000 r/min離心5 min，加入30 μL 0.1%甲酸，振蕩5 min，再加入200 μL乙腈，振蕩5 min，合并上清液，60℃真空抽干，質(zhì)譜檢測。

2.3?色譜及質(zhì)譜條件

2.3.1?色譜條件?反相C18分離柱（2 cm×100 μm×3 μm，美國Thermo Fisher公司）; 反相C18分析柱（15 cm×75 μm×3 μm， 尖端開口5～10 μm， 美國Thermo Fisher公司）; 液相色譜分離條件為： 流動相A為0.1%（V/V）甲酸， 流動相B為0.1%甲酸-80%（V/V）乙腈， 梯度洗脫： 0～14 min， 8%～12% B; 14～51 min， 12%～27% B; 51～68 min， 27%～40% B; 68～69 min， 40%～100% B; 69～75 min， 100% B; 流速為350 nL/min。

2.3.2?質(zhì)譜條件?納升級電噴霧離子源（Nanoelectrospray ionization）， 離子源電壓為2.0 kV， 母離子、子離子使用靜態(tài)軌道阱（Orbitrap）檢測; 一級掃描質(zhì)荷比（m/z）為300～1500， 分辨率為70000， 掃描模式為Top-speed， 一級掃描的自動增益控制（Automatic gain control， AGC）為3000000， 最大注入時間為60 ms; 二級掃描范圍自動設(shè)置， 分辨率為15000。離子隔離窗口為3 Th， 采用37%的能量進行高能碰撞解離（High-energy collisional dissocation， HCD）， 二級掃描的AGC為50000， 最大離子注入時間（Maximum ion injection time）為80 ms， 離子掃描電荷數(shù)為+2～+6， 排除同位素干擾峰， 動態(tài)排除時間為18 s。

2.4?質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析

樣品用0.1%甲酸復(fù)溶， 12000 r/min離心10 min，取上清液，用Easy-nLC 1000 nano液相色譜-Q Exactive Plus質(zhì)譜進行檢測，使用搭載Mascot 2.3搜索引擎的Proteome Discover 2.1（美國Thermo Fisher公司）進行搜庫，數(shù)據(jù)庫為人類生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)庫（更新至04/07/2013，包含蛋白質(zhì)數(shù)目為32015個）。母離子的質(zhì)量公差（Mass tolerances）為20 ppm，子離子為0.5 Da; 允許胰酶漏切位點數(shù)≤2; 肽段長度為7～25個氨基酸; 蛋白質(zhì)動態(tài)修飾為phosphor（Y）、phosohor（ST）、de Streak（C）、acetyl（protein N-term）、oxidation（M）。采用Percolator進行正反庫搜索，控制肽段水平的假陽性率（FDR）<1%。

基于數(shù)據(jù)依賴性模式（Data dependent acquisition， DDA）采集數(shù)據(jù)。采用iBAQ方法對鑒定的蛋白質(zhì)進行定量[14]，其基本原理為每個蛋白質(zhì)鑒定到的全部肽段曲線下的面積之和（AUCs）與此蛋白的理論酶切肽段數(shù)（N）之比為此蛋白的表達量（AUCs/N）。用FOT（Fraction of total）代表蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化后的峰面積[15]，即每個蛋白質(zhì)的iBAQ除以樣本中所有蛋白質(zhì)的iBAQ （FOT=iBAQ/∑iBAQ）。為了計算方便，將鑒定到的所有蛋白質(zhì)的FOT乘以105得到iFOT5。肽段篩選標(biāo)準(zhǔn)為： 每個蛋白質(zhì)被檢測的特異肽段數(shù)≥1，且Mascot ions scores≥20。數(shù)據(jù)分析采用兩樣本獨立t檢驗，若某轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合活性在親代和耐藥細(xì)胞中的比值大于1.5倍，且滿足P<0.05，則認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力增強，或轉(zhuǎn)錄因子表達量增加引起與DNA的結(jié)合能力增強，反之亦然。

2.5?Western blot檢測相關(guān)蛋白質(zhì)的表達

參照文獻[15]提取NCI N87和NCI N87/R細(xì)胞核蛋白，進行western blot實驗，抗體c-Jun、c-Myc、JunB和GAPDH稀釋倍數(shù)為1∶1000，二抗稀釋倍數(shù)為1：3000。目標(biāo)蛋白經(jīng)曝光后掃描圖像，采用Image J進行灰度值檢測并分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?pGEX4T2-catTFRE重組質(zhì)粒的提取與純化

參照文獻[10]進行重組質(zhì)粒pGEX4T2-catTFRE DNA提取與純化。結(jié)果顯示，在2.8 kb位置可見清晰且無干擾的目的條帶（圖1），與DL2000 DNA marker相比，提取質(zhì)粒濃度≥100 ng/μL，濃度及純度均符合實驗要求。

3.2?catTFRE pull down實驗

為檢測和定量分析曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，分別提取NCI N87和NCI N87/R細(xì)胞核蛋白，利用液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合catTFRE pull down的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對轉(zhuǎn)錄因子進行檢測和定量分析，采用生物信息學(xué)技術(shù)分析與DNA的結(jié)合活性顯著變化的轉(zhuǎn)錄因子（圖2）。

3.3?質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

對NCI N87和NCI N87/R樣本分別進行3次生物學(xué)重復(fù)實驗，基于Spearman方法進行相關(guān)性分析。每組中各個樣本的相關(guān)系數(shù)r>0.85（圖3），表明實驗重復(fù)性良好。

3.4?激活轉(zhuǎn)錄因子的篩選與分析

從肽段水平設(shè)置1% FDR，共鑒定得到轉(zhuǎn)錄因子359個。為明確數(shù)據(jù)分布，對NCI N87/R和NCI N87樣本的所有蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)（Fold change）進行總體分析，以NCI N87/R與NCI N87 3次生物學(xué)重復(fù)樣本中蛋白質(zhì)峰面積均值之比作為變化倍數(shù)，再進行對數(shù)轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)90%以上的蛋白質(zhì)在NCI N87/R/NCI N87中的變化倍數(shù)介于1.5倍范圍內(nèi)，不足10%的蛋白質(zhì)豐度變化較大（這些蛋白質(zhì)具有較小的iFOT （iFOT<1）），總體數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（圖4A）。因此，兩組樣本的均值滿足獨立樣本t檢驗分析。根據(jù)顯著性水平及均值的變化倍數(shù)繪制餅圖，若某轉(zhuǎn)錄因子在3次重復(fù)實驗的均值在兩組樣本中的比值大于1.5，即轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合活性或其表達量變化≥1.5倍（Fold change≥1.5）且p<0.05， 則認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子在耐藥細(xì)胞中被激活，其中Fold change（NCI N87/R/NCI N87）≥1.5且p<0.05表示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合活性增強或表達量增加; Fold change（NCI N87/R/NCI N87）≤0.67且p<0.05表示與DNA的結(jié)合活性減弱或表達量降低。結(jié)果表明，61個轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合活性在耐藥細(xì)胞中發(fā)生了顯著改變（電子版文后支持信息表S1），其中活性增強48個，活性減弱13個，活性未顯著改變298個（圖4B）。為更加直觀顯示轉(zhuǎn)錄因子的表達水平及其關(guān)系，依據(jù)生物學(xué)功能進行雙邊聚類分析，結(jié)果以熱圖形式可視化展示（圖4C）。聚類關(guān)系為層次聚類，測量方法為歐式距離法，聚類算法為均值，方塊顏色代表轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，紅色代表轉(zhuǎn)錄因子的表達量增加或與DNA的結(jié)合能力增強，綠色代表轉(zhuǎn)錄因子的表達量降低或與DNA的結(jié)合能力減弱（圖4C）。

3.5?Western blot分析部分激活轉(zhuǎn)錄因子的表達水平

基于Western blot檢測了c-Jun、c-Myc、JunB在NCI N87和NCI N87/R細(xì)胞中的表達水平，以進一步探究NCI N87/R細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子激活的可能原因。檢測結(jié)果表明，盡管c-Jun、c-Myc和JunB在NCI N87/R中的表達量有變化，但與NCI N87細(xì)胞相比，其表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p值分別為0.11、0.50和0.43），提示耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子激活可能由DNA結(jié)合活性的改變引起（圖5）。

3.6?激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控信號通路分析

利用STRING （https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對相互作用得分>0.7（高可信度）的轉(zhuǎn)錄因子進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，進一步基于WebGestalt數(shù)據(jù)庫（http：//www.webgestalt.org）中KEGG模塊進行通路富集分析，利用Cytoscape（v.3.6.0）軟件對富集結(jié)果進行可視化展示。篩選出顯著性水平p<1×103的信號通路有10條，分別是癌癥（p=1.33×106）、MAPK（p=4.16×105）、Wnt（p=7.34 ×105）、TGF-β（p=2.60 ×105）、凋亡（p=1.26 ×104）、DNA損傷（p =1.53 ×103）、PDGF（p=2.85×103）、白介素信號（p =4.72 ×103）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（p=6.62 ×103）及Toll受體信號通路（p=7.48×103） （電子版文后支持信息圖S1）?？梢悦黠@看出，在富集的所有通路中，癌癥、MAPK、Wnt、TGF-β及凋亡信號通路具有較小的p值（定量結(jié)果見圖6）。

MAPK、Wnt信號在腫瘤轉(zhuǎn)化、耐藥過程中相互影響，二者共同作用于GSK-3β，通過上調(diào)snail水平，降低E-cadherin表達，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生[16]。前期研究中[11，12]，已經(jīng)證實MAPK、Wnt信號激活貢獻胃癌曲妥珠單抗耐藥，但對激活信號通路的促動因子尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，TCF7L2、TCF7、JUN、MYC、FOXC1、FOS、DDIT3、ELK4、NFκB2、AFT2在激活MAPK、Wnt通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用; 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了調(diào)控TGF-β、凋亡通路的轉(zhuǎn)錄因子，這些結(jié)果為進一步闡明胃癌曲妥珠單抗耐藥機制奠定了基礎(chǔ)。

3.7?激活轉(zhuǎn)錄因子家族分類

對轉(zhuǎn)錄因子進行分類研究是了解其生物功能的重要途徑。本研究中鑒定得到的轉(zhuǎn)錄因子覆蓋了DBD數(shù)據(jù)庫（www.transcriptionfactor.org）中注釋的80%以上的轉(zhuǎn)錄因子家族，包括bZIP、bHLH、homeobox、HMG box、Hormone受體、GATA、Zine finger、ETS等（電子版文后支持信息圖S2）。這些轉(zhuǎn)錄因子具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、代謝、發(fā)育、癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能[7，17～19]。其中，ATF家族、TEF、NFIL3、JUN、JUNB、XBP1、DDIT3、FOSL1和FOS屬于bZIP家族，CUX1、PBX3、DLX3、HOXA4、HOXA3、MEIS1、PBX1和BARX1包含homebox結(jié)構(gòu)域，而FOXP1、ZNF740、ZNF282、KLF4和OVOL2歸屬于鋅指蛋白家族。TCF7、TCF7L2、FOXC1、JUN及MYC在腫瘤EMT誘導(dǎo)耐藥過程中發(fā)揮著重要作用[15，20，21]。

3.8?激活轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)分析

為進一步明確激活轉(zhuǎn)錄因子之間的互作關(guān)系，進而了解與曲妥珠單抗耐藥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，對激活轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控關(guān)系進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整個網(wǎng)絡(luò)以JUN和FOS為節(jié)點中心構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)“骨架”，其它轉(zhuǎn)錄因子分別以此為中心構(gòu)成下游網(wǎng)絡(luò)鄰居，其中JUN在整個網(wǎng)絡(luò)中起正向調(diào)控作用，F(xiàn)OS起負(fù)向調(diào)控作用（圖7A），以及由轉(zhuǎn)錄因子TCF7、TCF7L2、FOXC1、JUN和MYC組成的子網(wǎng)絡(luò)（圖7B），它們在腫瘤EMT過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。如TCF7L2與TCF7作為TCF/LEF家族成員，形成二聚體參與調(diào)控HMG box結(jié)合以及EMT、癌癥的轉(zhuǎn)移[22]，而且TCF7、TCF7L2和FOXC1也是Wnt通路的主要效應(yīng)分子[23～25]; 由FOS、JUN、MYC和ATF2等構(gòu)成的子網(wǎng)絡(luò)在MAPK通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用（圖7C）[26～28]。

3.9?激活轉(zhuǎn)錄因子-靶基因分析

基于CellNet轉(zhuǎn)錄因子-靶基因數(shù)據(jù)庫（http：//cellnet.hms.harvard.edu）構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[29]。將激活轉(zhuǎn)錄因子與蛋白質(zhì)表達譜中的差異性表達蛋白質(zhì)對接繪制網(wǎng)絡(luò)圖（圖8）（全蛋白質(zhì)表達譜數(shù)據(jù)見文獻[11]），整個網(wǎng)絡(luò)包括3個EMT-TFs調(diào)控模塊，每個模塊以TCF7L2、TCF7和FOXC1為效應(yīng)分子進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，主要發(fā)揮對靶基因的正向調(diào)控作用; 此外，以CASP8為中心構(gòu)成了負(fù)向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， CASP8被轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2、TCF7和FOXC1共同抑制，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。總體上，在耐藥細(xì)胞NCI N87/R中，TCF7L2、TCF7和FOXC1對EMT相關(guān)靶基因起正向調(diào)控作用，而對凋亡信號起負(fù)向調(diào)控作用。CASP8是細(xì)胞重要的凋亡分子，直接參與凋亡啟動和凋亡信號的活化過程，以及腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移等[30]。TCF7L2、TCF7和FOXC1負(fù)向調(diào)控CASP8的表達，導(dǎo)致耐藥細(xì)胞抗凋亡能力進一步增強。綜上，轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合活性變化與蛋白質(zhì)表達譜的結(jié)果相吻合，即胃癌細(xì)胞對曲妥珠單抗耐藥與EMT、Wnt、凋亡等多條信號通路的激活有關(guān)，提示針對這些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的信號通路可能是逆轉(zhuǎn)耐藥的有效途徑。

4?結(jié) 論

本研究基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜結(jié)合catTFRE pull down蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測并定量分析了NCI N87和NCI N87/R細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度分析了轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動NCI N87細(xì)胞對曲妥珠單抗耐藥的可能機制，并通過生物信息學(xué)手段分析了激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號通路，構(gòu)建了其調(diào)控關(guān)系，探究了轉(zhuǎn)錄因子-靶基因的調(diào)控作用，闡釋了EMT、Wnt、MAPK、凋亡等通路激活貢獻胃癌細(xì)胞對曲妥珠單抗的耐藥性，分析了調(diào)控EMT、Wnt和MAPK通路的多個靶基因。本研究為胃癌曲妥珠單抗耐藥機制研究提供了依據(jù)，也為逆轉(zhuǎn)其耐藥治療提供了參考。

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