龐森 吳向華 李貴彬 陳俊 黃精樂

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，術后易復發(fā)轉移，嚴重影響患者的生存［1］。因此，探討胃癌生長侵襲的機制，尋找治療胃癌的有效靶點尤為重要。細胞外信號調節(jié)激酶5（extracellular signal regulated kinase 5，ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號轉導通路家族新發(fā)現(xiàn)的成員之一。近年來多項研究提示ERK5與腫瘤的生物學行為密切相關，如，ERK5在乳腺癌［2］、前列腺癌［3］及結直腸癌［4］等多種惡性腫瘤中呈高表達并促進腫瘤的生長與侵襲。另有研究表明，胃癌組織中ERK5蛋白高表達可能與患者生存預后較差有關［5］。本研究檢測多種人胃癌細胞株及胃黏膜上皮細胞GES-1中ERK5 mRNA的表達水平，并采用RNA干擾技術敲低胃癌細胞SGC-7901、BGC-823中ERK5的表達，觀察沉默ERK5對胃癌細胞生長、侵襲等細胞生物學功能的影響，以期為胃癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌細胞株 SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27和人胃黏膜上皮細胞株GES-1購自中科院上海細胞庫；無糖型RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%含EDTA胰蛋白酶、澳洲胎牛血清購自美國Gibco公司；ERK5及內參GAPDH引物購自上海吉凱公司；qRT-PCR相關試劑盒購自日本Takara公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel生物膠購自美國BD公司；Annexin V-APC/7AAD凋亡試劑及細胞周期試劑購自杭州聯(lián)科生物公司。

1.2 方法

1.2.1 干擾序列的合成與慢病毒載體的構建 靶向干擾ERK5基因序列的短發(fā)莢RNA（shRNA）及陰性對照shRNA均委托上海吉凱公司設計合成，并克隆包裝至慢病毒載體中。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 各細胞株接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細胞轉染 胰酶收集胃癌細胞SGC-7901、BGC-823并接種于6孔板中。采用攜帶ERK5-shRNA及陰性對照shRNA的慢病毒分別對上述兩株細胞進行轉染（慢病毒感染復數(shù)：SGC-7901細胞MOI=10；BGC-823細胞MOI=100），并分別將SGC-7901細胞及BGC-823細胞分為沉默組（KD組）、陰性對照組（NC組），熒光倒置顯微鏡下觀察細胞慢病毒感染率，qRTPCR檢測ERK5基因的沉默效果。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中ERK5 mRNA的表達

Trizol法提取細胞總RNA，并用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。采用熒光定量PCR儀進行擴增。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃5 s，循環(huán) 40 次。以GAPDH為內參基因，2-ΔΔCt法分析各組細胞ERK5 mRNA的相對表達量。引物序列：ERK5上游引物為5'-GCCTGTTGGAACGCTGGACTC-3'，下游引物為 5'-GGAGGAGGACTGGTAGGTTGGAC-3'；內參 GAPDH上游引物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。實驗重復3次。

1.2.5 CCK-8法檢測胃癌細胞生長能力 將轉染后的胃癌細胞SGC-7901、BGC-823分別以2 000個/孔接種于96孔板，每組設5個復孔，連續(xù)培養(yǎng)4 d。分別在細胞接種 1 d、2 d、3 d、4 d 后每孔加入 10 μL CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。使用酶標儀檢測450 nm波長處各孔細胞吸光度值（OD450），根據(jù)吸光度值繪制胃癌細胞生長曲線圖。實驗重復3次。

1.2.6 平板克隆形成實驗檢測胃癌細胞克隆形成能力 將轉染后的胃癌細胞SGC-7901、BGC-823分別以1 000個/孔接種于6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)10 d。4%多聚甲醛固定細胞10 min，并以0.1%結晶紫溶液染色30 min。PBS清洗后拍照并計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。實驗重復3次。

1.2.7 Transwell小室法檢測胃癌細胞遷移和侵襲能力 用無血清培養(yǎng)基稀釋后的Matrigel基質膠包被Transwell小室底膜的上層面，待其聚合成凝膠。用胰酶收集轉染后的各組胃癌細胞，用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸5×104個細胞接種于小室上室，下室孔板中加入600 μL含15%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用棉簽輕輕擦去上室未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫溶液染色30 min，風干后顯微鏡下觀察計數(shù)穿膜細胞。細胞遷移實驗不需要提前鋪膠，其余步驟同侵襲實驗。實驗重復3次。

1.2.8 流式細胞儀檢測胃癌細胞凋亡與細胞周期 轉染后的胃癌細胞 SGC-7901、BGC-823 以 1×105個/孔接種于6孔板中連續(xù)培養(yǎng)3 d，用胰酶收集于離心管中。預冷PBS洗滌及離心細胞2次，分別進行細胞周期與細胞凋亡檢測。⑴細胞凋亡：每管細胞加入5 μL Annexin V-APC及10 μL 7AAD試劑混勻，室溫下避光孵育30 min，流式細胞儀（FACS）分析細胞凋亡情況。⑵細胞周期：每管細胞加入10 μL破膜劑及1 mL碘化丙啶（PI，50 μg/mL）溶液混勻，室溫下避光孵育1 h，F(xiàn)ACS儀分析細胞周期分布。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。胃癌和胃黏膜上皮細胞株ERK5 mRNA表達水平的組間比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計學意義，進一步的多重比較采用LSD檢驗。NC組與KD組細胞ERK5 mRNA表達水平、細胞克隆數(shù)、遷移、侵襲、凋亡和周期數(shù)據(jù)分析采用獨立樣本t檢驗。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ERK5 mRNA在胃癌細胞株中呈高表達

qRT-PCR 檢測結果顯示，SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27和GES-1細胞中ERK5 mRNA相對表達量分別為 2.696±0.501、1.865±0.185、1.793±0.137、1.530±0.093和1.008±0.158，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=14.724，P＜0.001）。與胃黏膜上皮細胞GES-1相比，胃癌細胞 SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27 中 ERK5 mRNA均顯著高表達（P＜0.001，0.003，0.005，0.003），見圖1。因此，本研究選取ERK5表達水平相對較高的胃癌細胞SGC-7901與BGC-823進行后續(xù)實驗。

2.2 轉染ERK5-shRNA沉默胃癌細胞SGC-7901、BGC-823中ERK5 mRNA的表達

熒光倒置顯微鏡下觀察慢病毒轉染后細胞綠色熒光蛋白表達，結果顯示，胃癌細胞SGC-7901、BGC-823慢病毒轉染效率均大于80%，見圖2A～B。qRT-PCR實驗結果顯示，SGC-7901細胞NC組與KD組中ERK5 mRNA相對表達量分別為1.000±0.029和0.256±0.019，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），KD組胃癌細胞沉默效率為（74.4±1.5）%，見圖 2C；BGC-823細胞 NC 組與BGC-823KD組中ERK5mRNA相對表達量分別為1.010±0.188 和 0.309±0.049，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002），KD組胃癌細胞沉默效率為（69.1±3.9）%，見圖2D。說明兩株胃癌細胞轉染成功，可用于后續(xù)功能實驗。

2.3 沉默ERK5可抑制胃癌細胞的生長能力

CCK-8實驗檢測結果顯示，在SGC-7901與BCG-823兩株胃癌細胞中，KD組細胞OD450值均顯著低于NC組細胞，提示沉默ERK5可抑制兩株胃癌細胞的生長能力。見圖3及表1。

圖1 不同胃癌細胞株及胃黏膜上皮細胞株中ERK5 mRNA的表達Fig.1 Expression of ERK5 mRNA in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cell line

圖2 慢病毒轉染后胃癌細胞中ERK5 mRNA的表達水平Fig.2 Expression levels of ERK5 mRNA in gastric cancer cells after lentiviral transfection

表1 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823 OD450值Tab.1 The OD450values of gastric cancer SGC-7901 and BGC-823 cells

圖3 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823生長曲線Fig.3 Growth curve of gastric cancer SGC-7901 and BGC-823 cells

2.4 沉默ERK5抑制了胃癌細胞克隆形成能力

平板克隆實驗結果顯示，SGC-7901細胞NC組與KD組細胞克隆形成數(shù)目分別為（858.333±22.066）個和（564.667±26.107）個，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；BGC-823細胞NC組與KD組細胞克隆形成數(shù)目分別為（458.000±18.457）個和（241.333±32.887）個，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。提示沉默ERK5可抑制兩株胃癌細胞克隆形成能力。

圖4 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823克隆形成情況Fig.4 Clonal formation of gastric cancer SGC-7901 and BGC-823 cells

2.5 沉默ERK5可抑制胃癌細胞的遷移與侵襲能力

Transwell遷移及侵襲實驗結果顯示，SGC-7901細胞NC組與KD組細胞遷移穿膜數(shù)分別為（161.000±13.928）個、（65.333±3.682）個，細胞侵襲穿膜數(shù)分別為（51.500±5.679）個、（12.333±2.494）個，與NC 組相比，KD 組細胞遷移穿膜數(shù)及細胞侵襲穿膜數(shù)均顯著減少（P=0.001，＜0.001），見圖5A。BGC-823細胞NC組與KD組細胞遷移穿膜數(shù)分別為（93.333±4.497）個、（59.667±3.091）個，細胞侵襲穿膜數(shù)分別為（35.000±4.123）個、（17.750±1.920）個，與NC組相比，KD組細胞遷移穿膜數(shù)及細胞侵襲穿膜數(shù)均顯著減少（P=0.001，0.014），見圖5B。說明沉默ERK5可抑制胃癌細胞的遷移及侵襲能力。

圖5 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823的遷移及侵襲情況Fig.5 Migration and invasion of gastric cancer SGC-7901 and BGC-823 cells

2.6 沉默ERK5促進胃癌細胞的凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示，SGC-7901細胞 NC組與KD組的細胞凋亡率分別為（4.767±0.509）%和（8.480±0.212）%；BGC-823細胞 NC 組與 KD 組細胞凋亡率分別為（5.890.±0.195）%和（11.587±1.176）%，SGC-7901、SGC-823胃癌細胞KD組細胞凋亡率均大于NC組的細胞凋亡率（P=0.001，0.002），見圖6。說明沉默ERK5可促進胃癌細胞的凋亡。

2.7 沉默ERK5改變了胃癌細胞的周期分布

流式細胞儀檢測結果顯示，SGC-7901細胞NC組與KD組的細胞SGC-7901、SGC-823周期分布比例G0/G1期分別為（55.787±1.035）%和（69.997±2.570）%；S期分別為（25.643±0.693）%和（21.110±1.507）%；G2/M 期分別為（17.567±0.753）%和（8.897±1.068）%，NC組與KD組各周期分布比例差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002，0.018，0.001），見圖 7A。BGC-823 細胞 NC組與KD組細胞周期分布比例G0/G1期分別為（51.413±1.574）%和 （64.240±0.612）%，S 期分別為（33.863±1.228）%和（26.603±2.630）%，G2/M 期分別為（14.723±0.487）%和（9.827±1.649）%，NC 組與 KD 組各周期分布比例差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，0.024，0.016），見圖7B。說明沉默ERK5可改變兩株胃癌細胞各周期分布比例，主要引起G0/G1期細胞周期阻滯。

圖6 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823凋亡分布Fig.6 Distribution of apoptosis in gastric cancer SGC-7901 and BGC-823 cells

圖7 胃癌細胞SGC-7901、BGC-823周期分布情況Fig.7 Cell cycle distribution of gastric cancer SGC-7901 and BGC-823 cells

3 討論

據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計資料顯示，2018年全球胃癌新增病例約103萬，死亡病例約78萬，病死率僅次于肺癌［6］。胃癌發(fā)病隱匿，早期臨床特征不明顯，患者就診時往往處于進展期，傳統(tǒng)手術及化療治療效果有限，預后較差。隨著分子生物學的快速發(fā)展，靶向治療具有特異性強、副作用小等優(yōu)點，成為胃癌治療的研究熱點。但目前胃癌靶向治療進展較緩慢，尋找合適的靶標并闡明其相關功能，將有助于改善胃癌治療現(xiàn)狀［7］。

MAPK信號轉導通路在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［8］，ERK5作為MAPK信號通路的成員之一，與腫瘤的生長、侵襲密切相關。有研究報道ERK5被MEK5α激活移位到細胞核內進而發(fā)揮調節(jié)轉錄功能［9］。研究發(fā)現(xiàn)ERK5在乳腺癌組織中呈高表達并促進乳腺癌細胞生長［2］。ERK5抑制劑可促進白血病細胞Kasumi-1和HL-60凋亡［10］。MEK5-ERK5通路的抑制可調控周期蛋白D1、周期蛋白E和CDK4的表達，進而誘導G1期細胞周期阻滯導致鼻咽癌細胞CNE1的生長抑制［11］。此外，還有研究認為在胃癌組織中ERK5表達水平與腫瘤惡性程度有關［12］,推測ERK5可能對胃癌的生長、侵襲有著重要的調控作用。因此，本研究進一步分析ERK5在胃癌細胞中的生物學功能，以期對胃癌的靶向治療提供新思路。

本研究檢測了多種人胃癌細胞株和人胃黏膜上皮細胞株GES-1中ERK5 mRNA的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞 SGC-7901、BGC-823、AGS 與 HGC-27 中ERK5 mRNA的表達水平均顯著高于胃黏膜上皮細胞。且其中選取ERK5表達水平較高的胃癌細胞SGC-7901與BGC-823進行了一系列細胞功能學實驗，結果發(fā)現(xiàn)，沉默胃癌細胞中ERK5的表達可抑制胃癌細胞的生長并促進其凋亡。同時，沉默ERK5還抑制了胃癌細胞的遷移與侵襲能力，表明ERK5的高水平表達可能與胃癌細胞的高轉移性有關。此外，沉默ERK5還影響胃癌細胞的周期分布，使細胞阻滯在G1期，進而導致胃癌細胞的生長抑制。有研究發(fā)現(xiàn)ERK5調控胃癌細胞的生長可能是通過抑制細胞凋亡和促進細胞周期進展而實現(xiàn)［13］，但具體機制仍需進一步闡明。在白血病中，有研究發(fā)現(xiàn)ERK5通過負反饋調節(jié)microRNA-143介導的Fas凋亡途徑影響細胞凋亡［14］。ERK5也可通過TGFβ介導的上皮-間質轉化（EMT）途徑調控乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力［15］。在胃癌中ERK5亦可能通過類似的分子機制調控胃癌細胞的凋亡和侵襲能力，有關方面值得進一步深入研究。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實了沉默ERK5對胃癌細胞生長侵襲能力具有抑制作用。但本研究僅探討了ERK5對胃癌細胞生物學功能的影響，在未來的研究中將進一步闡明ERK5影響胃癌細胞生長侵襲的具體分子機制，ERK5有望成為胃癌治療的新靶點。