趙新永 李曉婷 周飛

(1鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 451150；2復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院)

左歸丸為經(jīng)典補腎古方，出自明代張景岳的《景岳全書·新方八陣》。該方在臨床上不僅應(yīng)用于治療老年性骨質(zhì)疏松，而且也被廣泛用于治療腎虛型老年性記憶衰退。研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸確實具有延緩機體神經(jīng)內(nèi)分泌退行性變化及補腎健腦的功效〔1〕。衰老性記憶下降主要是因為隨著年齡的增長，大腦中樞神經(jīng)細胞的功能逐漸減退所造成。而大腦中樞神經(jīng)細胞的功能減退又和線粒體的功能正常與否密切相關(guān)。大腦消耗了人體20%的氧氣，而輸送大腦的葡萄糖中99%都是用于提供能量〔2,3〕，而這些能量的產(chǎn)生絕大部分是由線粒體的有氧代謝來提供。在衰老的大腦中，幾乎都伴隨線粒體的功能障礙〔4〕。而且如果改善線粒體的功能，就能改變細胞活性，進而改善衰老大腦的功能〔5〕。前期研究中，在離體培養(yǎng)的海馬細胞上也發(fā)現(xiàn)左歸丸可能增強海馬神經(jīng)細胞的活性，但并未對其機制進一步探討〔6〕。而目前對左歸丸改善衰老性記憶減退，多集中在記憶有關(guān)的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面〔7～9〕。但左歸丸能否作用于中樞神經(jīng)線粒體及作用如何，并沒有明確的研究報道。本研究擬觀察補腎方藥左歸丸對衰老大鼠線粒體能量代謝的作用及可能的機制變化，進一步探索左歸丸延緩衰老和改善學(xué)習(xí)記憶的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠40只,體重180～250 g,24月齡，合格證號SCXK(滬) 2016-0001，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(24±2)℃,相對濕度(50±10)%,大鼠維持自由飲食、飲水。

1.2 藥物及試劑 方藥組成參見文獻〔6〕。 各中藥飲片購自上海華宇中藥飲片有限公司。制備方法為常規(guī)水煎液制成浸膏，左歸丸藥液含生藥量為1.60 g/ml。單磷酸腺苷(AMP)鈉,二磷酸腺苷(ADP)鈉鹽,三磷酸腺苷(ATP) 二鈉鹽對照品(美國Sigma-Aldrich公司)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；丙酮酸脫氫酶(PDH)及α-酮戊二酸脫氫酶(KGDH) 活性檢測試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；辣根過氧化物酶(HPR)標記的山羊抗兔單抗及HPR山羊抗小鼠單抗(美國Santa Cruz公司)；過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子(PGC)-1α一抗抗體(美國Bio Vision公司)；β-肌動蛋白(actin) 抗體；聚偏氟乙烯(PVDF)膜和顯影液(美國Millipore公司) 。

1.3 儀器 Morris水迷宮及分析軟件分別為中國科學(xué)院神經(jīng)研究所的DMS-2型和上海吉量軟件科技有限公司的DigBehv-MG 型分析軟件。低溫超速離心機(日本Hitachi公司CP100WX型),高效液相色譜儀(美國Waters公司2695型),紫外分光光度計(美國Amersham Biosciences公司),PowerPacTMHC 型蛋白電泳儀，Mini Protean 3 Cell 型電泳槽、轉(zhuǎn)移槽，biorad ChemiDoc MP 型凝膠成像分析系統(tǒng)，全波長酶標儀(美國Bio Tex公司) 。

1.4 動物分組及給藥 隨機分為對照組和左歸丸組，每組20只。灌胃給藥,按照人臨床日用藥量15 g浸膏折算大鼠給藥量,左歸丸給藥劑量為12.12 g/kg,對照組灌服等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)灌胃60 d。

1.5 Morris水迷宮法測試空間學(xué)習(xí)記憶能力 給藥60 d后,進行Morris水迷宮實驗,期間繼續(xù)給藥。每天從兩個方向開始訓(xùn)練大鼠，2次/d，連續(xù)5 d。設(shè)定水中的游動時間最長為70 s，計算機自動記錄大鼠的潛伏期。如未在最長時間內(nèi)找到目標，則潛伏期為最長時間，將其引至平臺上停留20 s。記錄每組的潛伏期，計算其平均值并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 腦組織AMP、ADP、ATP含量及能荷(EC) 測定 Morris水迷宮試驗后,取腦置于玻璃勻漿器中,加入生理鹽水在冰浴下制成20%腦勻漿液,加4%高氯酸0.5 ml混勻,4℃條件下12 000 r/min離心20 min,取0.5 ml上清液加20%氫氧化鉀(KOH)80 μl,用高效液相色譜法(HPLC)測定AMP、ADP、ATP的含量。EC=(ATP+0.5ADP) /(ATP+ADP+AMP)。

1.7 PDH和KGDH活性檢測 按照相關(guān)試劑盒說明書，在600 nm下測定吸光度A變化來計算PDH和KGDH活性。

1.8 腦組織線粒體膜電位測定 具體操作步驟參照試劑盒說明書進行熒光法測定。首先分離腦組織線粒體,用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解,再加入7.5倍的PBS混勻，然后取1.5 ml離心，棄去上清,再加入染色液1.25 ml染色3 min,染色時要注意避光和保溫，37℃下進行。590 nm和530 nm處測定，計算A590/A530比值。

1.9 Western印跡測定PGC-1α蛋白水平 大鼠測試結(jié)束后水合氯醛麻醉。取一定量腦組織，加入4℃放射免疫沉淀(RIPA)裂解液900 μl(含有100 nmol/L蛋白酶抑制劑),0℃勻漿，13 000 r/min離心15 min,取上清液。雙縮脲法定量蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,每孔上樣量為50 μg蛋白。電壓100 V、15 min,120 V恒壓、90 min。轉(zhuǎn)膜:濕轉(zhuǎn),200 mA恒流。洗PVDF膜3次，5 min/次,封閉液封閉1.5 h。分別加一抗PGC-1α和內(nèi)參β-actin,稀釋比例參照抗體說明書，4℃避光孵育過夜。洗膜,加入抗兔HRP(稀釋比例為1∶5 000),室溫避光，與二抗稀釋液孵育1.5 h。加發(fā)光劑曝光,壓片顯影。膠片進行灰度掃描計算PGC-12/α-actin比值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組潛伏期比較 訓(xùn)練前3 d，兩組潛伏期逐漸縮短，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組第4、5天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。且左歸丸組穿越平臺次數(shù)〔(19.00±2.20)次〕顯著多于對照組〔(6.67±1.63)次，P<0.01〕。見表1。

2.2 兩組腦組織AMP、ADP、ATP含量及EC值比較 與對照組比較,左歸丸組腦內(nèi)AMP含量降低，ADP含量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而ATP含量和EC值明顯升高(P<0.05,P<0.01) 。見表2。

表1 兩組潛伏期比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 兩組AMP、ADP、ATP含量及EC值比較

2.3 兩組腦組織PDH和KGDH活性比較 左歸丸組腦組織PDH和KGDH活性〔(62.15±4.56)、(20.13±1.78)nmol/(min·mg)〕顯著高于對照組〔(40.23±3.56)、(16.67±1.46)nmol/(min·mg)，P<0.01〕。

2.4 兩組腦組織線粒體膜電位比較 與對照組(2.92±0.42)比較,左歸丸組(6.26±0.38)可明顯提高線粒體膜電位(P<0.01) 。

2.5 兩組腦組織PGC-1α通路蛋白表達比較 相較于對照組(0.422±0.122),左歸丸組PGC-1α表達(0.853±0.131)顯著增加(P<0.01),見圖1。

圖1 左歸丸對自然衰老大鼠腦組織PGC-1α蛋白表達的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，給予左歸丸治療衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高，和以往研究結(jié)果一致，說明左歸丸確實能夠改善和延緩自然衰老所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)功能減退〔8,9〕。研究表明，隨著衰老，大腦中樞的能量代謝水平顯著下降，且認知也隨著下降，而能量下降的原因是線粒體的損害和功能障礙,其主要表現(xiàn)是ATP生成下降，膜電位改變及EC顯著降低〔10〕。而本研究結(jié)果顯示,左歸丸能夠明顯增加自然衰老大鼠腦內(nèi)ATP的產(chǎn)生及EC水平,有效改善自然衰老大鼠中樞神經(jīng)細胞的能量代謝。

ATP的產(chǎn)生主要和線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)代謝通路和線粒體膜的完整密切有關(guān)。在衰老人群和衰老動物中,該循環(huán)和線粒體膜都出現(xiàn)不同的損害。在三羧酸循環(huán)中，幾乎所有的代謝關(guān)鍵酶都出現(xiàn)了不同程度的下降，其中PDH和KGDH活力的下降特別顯著〔11〕。線粒體膜電位決定了電子鏈正常傳遞及氧化磷酸的正常進行。而左歸丸能夠改善線粒體膜的正常電位，從而提高ATP的產(chǎn)生，保證了神經(jīng)細胞的正常能量需要。

Carelli等〔12〕發(fā)現(xiàn)，在衰老細胞內(nèi)，線粒體的老化和功能障礙主要是因為線粒體動力代謝下降所致，特別是增生分裂下降，不能提供新生線粒體。而PGC-1α是促進線粒體增生和更新的重要調(diào)控蛋白，可以激活下游一系列其他蛋白轉(zhuǎn)錄因子如核呼吸因子(NRF)1和NRF2、線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)〔13,14〕，這些蛋白會促使新的線粒體增生，替代老化的或受損的線粒體，保持線粒體的功能正常。在衰老的機體內(nèi)，通常發(fā)現(xiàn)PGC-1α蛋白表達降低，導(dǎo)致線粒體更新速率減慢，從而影響能量代謝〔15〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以顯著促進PGC-1α蛋白表達，從而促進線粒體的增生和更新。本研究結(jié)果提示，左歸丸可能通過促進線粒體的及時更新而改善線粒體功能。所以，左歸丸對大腦中樞神經(jīng)的線粒體功能的改善和提高也可能是提高衰老性記憶的機制之一，而且因為改善了中樞神經(jīng)細胞的能量代謝，從而延緩其衰老，更符合中醫(yī)補精生髓的內(nèi)涵。