孔凡女 李清林

青光眼是一組以視盤萎縮及凹陷，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglial cells，RGCs)丟失并伴有視力下降為特征的眼科疾病[1]。視神經(jīng)供血不足及病理性眼壓增高是青光眼發(fā)病的主要危險因素；此外，視神經(jīng)對壓力損害的耐受性也與青光眼的發(fā)生存在密切聯(lián)系[2]。目前，關(guān)于RGCs損傷的機制尚未明確，相關(guān)研究指出[3]，RGCs進(jìn)行性死亡所致的青光眼性視神經(jīng)病變主要由RGCs凋亡引起，因此保護(hù)RGCs避免視神經(jīng)受損對治療青光眼具有重要意義。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類存在于生物細(xì)胞體內(nèi)的熱應(yīng)激蛋白質(zhì)，其在機體內(nèi)參與細(xì)胞的正常生長、發(fā)育和分化[4]。國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果證實[5]，HSP72抗體具有促進(jìn)RGCs凋亡的作用。目前關(guān)于HSP72對大鼠青光眼模型RGCs和視神經(jīng)的保護(hù)作用的研究報道仍較少，本研究利用Wistar大鼠制作青光眼動物模型，探究HSP72對青光眼模型大鼠RGCs和視神經(jīng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選取Wistar大鼠46只，體質(zhì)量200～250 g，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(6只)和實驗組(共40只，全部建立青光眼模型)。建模后取實驗組8只大鼠作為實驗對照組，不做處理；16只作為熱休克反應(yīng)組，2 d后給予熱休克反應(yīng)處理；另外16只作為硫酸鋅注射組，2 d后給予硫酸鋅腹腔注射處理。

1.2 方法

1.2.1 大鼠青光眼模型建立于大鼠腿部按照1 mL·kg-1體質(zhì)量肌肉注射速眠新Ⅱ注射液，右眼滴入一滴1 g·L-1地卡因。設(shè)置激光機(澳大利亞Ellex公司)參數(shù)為0.7 s/0.4 W，光斑直徑200 μm。通過角膜緣，激光束以銳角直接射入小梁網(wǎng)，每眼光凝360° 80～100個點。所有建模大鼠均給予右眼2次激光光凝，每2次光凝相隔7 d。

1.2.2 實驗處理熱休克反應(yīng)：按照0.02 mL·kg-1體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腹腔注射100 g·L-1水合氯醛進(jìn)行麻醉，將大鼠置于無蓋鋁盒并漂浮于恒溫為43 ℃水中，測量大鼠肛溫，大鼠肛溫保持在40～42 ℃，15 min后將大鼠取出，待其自行恢復(fù)。硫酸鋅注射：取24.6 mg·kg-1硫酸鋅粉劑溶于2 mL濃度為0.01 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，抽取硫酸鋅溶液注入大鼠腹腔內(nèi)，30 min后如無異常反應(yīng)將大鼠送回鼠舍。

1.2.3 眼壓測定分別于激光前及激光后3 d、7 d、14 d、28 d測量實驗對照組、硫酸鋅注射組及熱休克反應(yīng)組大鼠的雙眼眼壓。檢查方法：按照0.02 mL·kg-1體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腹腔注射100 g·L-1水合氯醛進(jìn)行麻醉，待麻醉顯效后給予大鼠雙眼滴入5 g·L-1丁卡因眼液，采用Tono-Pen XL眼壓計筆尖輕輕接觸角膜，讀取3次眼壓值，取平均值。

1.2.4 Western blot檢測實驗對照組給予大鼠右眼前房內(nèi)加壓灌注，分別于激光后3 d、7 d、14 d、28 d 各時間點處死大鼠；硫酸鋅注射組給予大鼠腹腔硫酸鋅注射，分別于相同時間點處死大鼠；熱休克反應(yīng)組給予大鼠熱休克反應(yīng)處理，分別于相同時間點處死大鼠。處死后，即刻行右眼摘除及視網(wǎng)膜剝離，采用0.01 mol·L-1的PBS緩沖液進(jìn)行2次漂洗。取出視網(wǎng)膜并碾碎置于離心管內(nèi)，將體積約5倍的預(yù)冷懸浮緩沖液迅速加入離心管內(nèi)，置于沸水浴中加熱10 min。待其冷卻后4500 r·min-1離心10 min，獲取上清液并保存于-20 ℃冰箱。完成樣本采集后采用紫外分光光度儀檢測蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行Western blot分析。均按照1500稀釋單克隆鼠抗體以及羊抗鼠多克隆抗體，溫育1 h。二氨基聯(lián)苯胺化學(xué)反應(yīng)顯色及辣根過氧化物酶聯(lián)合抗體染色。

1.2.5 RGCs計數(shù)400倍光鏡下，在視網(wǎng)膜鼻上、鼻下、顳上、顳下四個象限內(nèi)，分別距離視盤中心1 mm、2 mm、3 mm處各取一個矩形(0.078 mm×0.058 mm)染色照相。根據(jù)RGCs染色特點，采用圖像分析軟件統(tǒng)計每張照片RGCs數(shù)并計算細(xì)胞密度。取12個矩形內(nèi)RGCs密度的均值作為整個視網(wǎng)膜的RGCs平均密度。

2 結(jié)果

2.1 激光處理前后大鼠眼壓的比較各組建模大鼠均成功建立青光眼模型，激光后3 d、7 d、14 d、28 d，各組大鼠右眼眼壓均較激光處理前有所上升，且各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見表1。

表1 各組激光處理前后大鼠眼壓的比較

注：1 kPa=7.5 mmHg

2.2 不同時間點各組RGCs中HSP72抗體含量正常對照組在不同時間點RGCs中HSP72抗體均無表達(dá)，激光后3 d實驗組各組RGCs中HSP72抗體含量緩慢上升，激光7 d、14 d達(dá)高峰，此后逐漸下降至接近正常水平。激光后實驗組各組RGCs中HSP72抗體含量顯著高于正常對照組，且熱休克反應(yīng)組RGCs HSP72抗體含量均高于實驗對照組，低于硫酸鋅注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間點RGCs中HSP72抗體含量的比較

2.3 各組RGCs平均密度的比較激光后3 d、7 d、14 d、28 d實驗組各組大鼠RGCs平均密度均明顯低于正常對照組(均為P<0.05)，且熱休克反應(yīng)組RGCs平均密度均顯著高于實驗對照組和硫酸鋅注射組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。見表3。

表3 各組RGCs平均密度的比較

注：P1，2值表示實驗對照組與正常對照組比較，P1，3值表示熱休克反應(yīng)組與正常對照組比較，P1，4值表示硫酸鋅注射組與正常對照組比較。與實驗對照組比較，*P<0.05；與熱休克反應(yīng)組比較，#P<0.05

3 討論

青光眼是全球三大致盲眼病之一，其發(fā)病機制尚未明確，因此仍無確切有效的治療方法。多數(shù)青光眼患者在接受治療后無法阻斷視神經(jīng)病變的發(fā)展，從而導(dǎo)致視力減退。研究認(rèn)為[6]，引起青光眼視神經(jīng)受損的主要原因為視網(wǎng)膜缺血、機械性損傷、神經(jīng)營養(yǎng)因子丟失以及興奮性毒素谷氨酸的釋放等。目前，臨床上治療青光眼的主要方法為降低眼壓，緩解視神經(jīng)損害的發(fā)展等[7-8]。但該治療方法對于壓力依賴性青光眼有效，而無法阻斷非壓力依賴性青光眼患者視神經(jīng)病變的進(jìn)展。有報道指出[9]，青光眼性視神經(jīng)病變主要由RGCs進(jìn)行性凋亡引起，因此保護(hù)RGCs及視神經(jīng)受損為目前主要治療原則。HSP是一類存在于所有生物細(xì)胞體內(nèi)的熱應(yīng)激蛋白質(zhì)，當(dāng)機體受到缺血、組織損傷、高溫及興奮性毒素時，該蛋白能通過在神經(jīng)元細(xì)胞中改變基因表達(dá)方式，進(jìn)而引起內(nèi)源性保護(hù)機制的應(yīng)激反應(yīng)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[12]，含有HSP72基因的大鼠體內(nèi)隨著HSP72的表達(dá)上升，其機體神經(jīng)元會對損傷和缺血的耐受性增強。實驗研究證實[13-14]，正常組大鼠視網(wǎng)膜無HSP72的表達(dá)，當(dāng)其受到高溫、感染、缺氧等應(yīng)急狀況，其體內(nèi)HSP72蛋白濃度上升，視網(wǎng)膜的抗損傷能力就會增強。大量研究顯示[8]，鋅離子能夠誘導(dǎo)HSP72在各組織中表達(dá)，而且無顯著不良反應(yīng)發(fā)生。

HSP72包含兩個結(jié)構(gòu)域，一個為N端ATP酶活性的高度保守序列，另一結(jié)構(gòu)域為C端的可結(jié)合熱休克轉(zhuǎn)錄因子的識別序列。熱休克反應(yīng)過程中，損害機體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使外露的疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合HSP702，從而導(dǎo)致HSP被游離出來形成三聚體。后者移位核內(nèi)后，結(jié)合熱休克基因上游的轉(zhuǎn)錄啟動序列，快速轉(zhuǎn)錄HSP702，從而使細(xì)胞內(nèi)的HSP72濃度上升。本實驗中的熱休克反應(yīng)組，升高Wistar大鼠體溫使其處于熱應(yīng)激狀態(tài)下，從而可以增加HSP72在各組織細(xì)胞中的表達(dá)。大鼠腹腔內(nèi)行硫酸鋅注射可誘導(dǎo)RGCs產(chǎn)生HSP72，神經(jīng)元細(xì)胞注入高濃度鋅離子，抑制磷酸甘油醛脫氫酶，從而降低細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤含量，進(jìn)而抑制糖酵解過程，最終造成神經(jīng)元細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)障礙，降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平。本實驗中，硫酸鋅注射組升高鋅離子在大鼠體液中的濃度，抑制神經(jīng)元細(xì)胞能量代謝，最終誘導(dǎo)RGCs產(chǎn)生HSP72。研究結(jié)果顯示，熱休克反應(yīng)組在不同時間點RGCs中HSP72抗體含量顯著低于硫酸鋅注射組，提示HSP可有效減緩RGCs凋亡。Wang等[15]采用硫酸鋅和槲皮素對Wistar大鼠行腹腔內(nèi)注射，結(jié)果顯示大鼠腹腔內(nèi)行槲皮素注射后，其RGCs存活率與注射前無顯著差異，而硫酸鋅組的RGCs存活率顯著高于未接受注射組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激光后不同時間點實驗組各組RGCs平均密度均顯著低于正常對照組，且不同時期的熱休克反應(yīng)組RGCs平均密度均顯著高于實驗對照組和硫酸鋅注射組，提示高眼壓之前給予大鼠熱休克反應(yīng)處理和硫酸鋅腹腔內(nèi)注射，能夠誘使其組織中生成HSP72，從而增加RGCs的存活率，最終達(dá)到保護(hù)RGCs的作用。