劉欣欣 盧愛東 王亞星 魏文斌 陳朔華 吳壽嶺

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是含有細(xì)胞毒性的一種含硫氨基酸，是蛋氨酸脫甲基過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物。近期有研究提出，升高的Hcy水平是冠心病(coronary heart disease，CHD)等心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]。高Hcy水平除了被廣泛用作CVD的預(yù)測(cè)因子外，有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy和非心臟血管疾病之間的關(guān)系同樣密切，高Hcy血癥與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄有關(guān)，與中風(fēng)、外周動(dòng)脈疾病、頸動(dòng)脈疾病、慢性腎臟疾病、動(dòng)脈粥樣硬化性腎動(dòng)脈狹窄、腹主動(dòng)脈瘤和勃起功能障礙均相關(guān)[2]。既往對(duì)Hcy在眼內(nèi)血管性病變中的作用和影響方面研究發(fā)現(xiàn)，高Hcy在年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)病過程中均扮演了重要的角色[3-5]，但這些研究多局限在已發(fā)病患者的眼內(nèi)局部組織的生理改變，血漿中Hcy水平和大型人群中的眼內(nèi)血管變化情況的關(guān)系卻少有研究報(bào)道。

在流行病學(xué)調(diào)查中，多利用眼底彩色照相技術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜血管進(jìn)行定性觀察和定量測(cè)量，從而對(duì)其與心腦血管疾病的關(guān)系進(jìn)行研究。研究表明，視網(wǎng)膜微血管的改變可以用作觀測(cè)和指示指標(biāo)對(duì)全身微血管病變的臨床前期進(jìn)行評(píng)估[6]。然而，對(duì)于血漿內(nèi)Hcy水平和視網(wǎng)膜微血管改變的研究尚少。本研究將從流行病學(xué)方向，采用計(jì)算機(jī)分析軟件及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)公式對(duì)視網(wǎng)膜血管直徑進(jìn)行定量測(cè)量，從而對(duì)血漿內(nèi)Hcy水平與視網(wǎng)膜微血管改變間的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料開灤研究(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-TNC-11001489)中2012-2013年參加健康體檢(年齡≥40歲)并自愿行眼部檢查并行眼底彩色照相的人群。開灤研究是基于河北省唐山市開灤社區(qū)對(duì)開灤集團(tuán)在職及離退休員工進(jìn)行健康體檢并隨訪的前瞻性隊(duì)列研究。人群來源：2006年6月至2007年10月和2008年6月至2009年10月由開灤總醫(yī)院等11家醫(yī)院對(duì)開灤集團(tuán)在職及離退休職工分別進(jìn)行2次健康體檢。2009年12月由首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院腦卒中臨床試驗(yàn)和研究中心人員，在上述健康體檢職工中按2005年全國(guó)1%人口抽樣調(diào)查所得的40歲以上全國(guó)人口性別和年齡的比例[7]，根據(jù)每2歲一個(gè)年齡段按比例分層隨機(jī)抽取開灤集團(tuán)職工作為觀察人群，并于每2 a一次對(duì)觀察人群進(jìn)行體檢。本課題采用的是2012-2013年的橫斷面人群資料。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥40歲；(2)種族、年齡不限；(3)無認(rèn)知能力障礙，可完成調(diào)查問卷者；(4)同意參加此研究并且簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往史有缺血性腦卒中、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血病史者；(2)既往有心肌梗死病史者；(3)未能完成眼底彩照檢查者或采集眼底照片質(zhì)量不符合軟件分析要求者。

1.3 流行病學(xué)調(diào)查、人體測(cè)量指標(biāo)和生化指標(biāo)檢測(cè)開灤隊(duì)列研究均采用一致性的流行病學(xué)調(diào)查問卷及人體測(cè)量指標(biāo)和生化指標(biāo)檢測(cè)，可見本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[8-9]，其中本研究的調(diào)查員及體檢醫(yī)師均為固定人員且經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)。血壓測(cè)量方法：受試對(duì)象于體檢當(dāng)天上午測(cè)量前30 min內(nèi)禁止吸煙或飲茶、咖啡，背靠靜坐15 min后進(jìn)行血壓測(cè)量。應(yīng)用經(jīng)校正的汞柱式血壓計(jì)來測(cè)量受試者右側(cè)肱動(dòng)脈血壓，連續(xù)測(cè)量3次，結(jié)果取均值。吸煙的定義為受試者每天至少吸一支煙，至少持續(xù)1 a以上；飲酒的定義為受試者每天平均飲白酒(酒精含量50%以上)100 mL，至少持續(xù)1 a以上。測(cè)量身高(精確到 1 mm)和體質(zhì)量(精確到0.1 kg)，計(jì)算其BMI(kg·m-2)。于體檢當(dāng)天上午700-900抽取受試者空腹肘靜脈血5 mL，分離并提取血清，用于生化測(cè)量指標(biāo)的檢測(cè)。生化指標(biāo)包括：空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、高敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)及Hcy等。所有受試者血清統(tǒng)一用日立7600自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，并由同一組專業(yè)檢驗(yàn)醫(yī)師進(jìn)行操作。Hcy采用免疫比濁法測(cè)定，試劑盒由北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司提供，操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，隨批質(zhì)控。

1.4 視網(wǎng)膜血管直徑的測(cè)量由熟練的眼科技師操作免散瞳眼底彩色照相儀(Type CR6-45NM；Canon，Ota，Tokyo，Japan)拍攝受試者的彩色眼底照(45°)，分別以其雙眼視盤和黃斑為中心進(jìn)行照片采集。均選用受試者右眼彩色眼底照片，利用計(jì)算機(jī)分析軟件(IVAN；University of Wisconsin，Madison，WI)測(cè)量眼底距離視盤邊緣0.5～1.0 PD的6條較大的視網(wǎng)膜分支動(dòng)脈和靜脈直徑，使用 Knudtson-Parr-Hubbard 公式[10]計(jì)算下列參數(shù)：視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈直徑(central retinal artery equivalent，CRAE)、視網(wǎng)膜中央靜脈直徑(central retinal vein equivalent，CRVE) 和視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈比(arteriovenous ratio，AVR)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況2012-2013年行全身及眼部檢查的查體人群(年齡≥40歲)共3447人，其中男1936人。排除輸入錯(cuò)誤導(dǎo)致血管極值26人，未進(jìn)行Hcy檢查的人數(shù)20人，納入本研究統(tǒng)計(jì)分析人群3401人，男1910人、女1491人。研究對(duì)象年齡為(56.81±10.17)歲，Hcy為0.09～70.60(15.27±9.11)mmol·L-1，其中CRAE為(174.29±24.59)μm、CRVE為(281.74±28.66)μm、AVR為0.62±0.11。將Hcy按四分位分組(Hcy四分位數(shù)分別為9.50 mmol·L-1、13.30 mmol·L-1、18.20 mmol·L-1)，體檢人群的相關(guān)因素測(cè)量值見表1。

表1 所有觀察對(duì)象的基線情況

注：SBP：收縮壓；1 kPa=7.5 mmHg

2.2 Hcy與CRAE、CRVE、AVR間相關(guān)性分析Spearman相關(guān)分析顯示，Hcy與CRAE呈負(fù)相關(guān)(r=-0.125，P<0.001)，與CRVE呈負(fù)相關(guān)(r=-0.093，P<0.001)，Hcy與AVR也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.050，P=0.004)

2.3 影響CRAE、CRVE、AVR的多因素線性回歸分析模型1分別以CRAE、CRVE和AVR作為因變量，Hcy測(cè)量值作為自變量，采用線性回歸分析Hcy對(duì)CRAE、CRVE和AVR的影響，結(jié)果顯示，Hcy是CRAE(β=-0.292，P<0.001)、CRVE(β=-0.241，P<0.001)和AVR(β=-0.001，P=0.003)的影響因素。模型2在模型1的基礎(chǔ)上校正了年齡、性別，結(jié)果顯示，Hcy是CRAE(β=-0.101，P=0.034)和CRVE(β=-0.142，P=0.004)的影響因素，對(duì)AVR的影響不具有相關(guān)性。在考慮了全身各因素的共線性后，模型3在模型2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步校正了BMI、SBP、FBG、LDL-C、HDL-C、hsCRP、吸煙、飲酒后，結(jié)果顯示，Hcy仍是CRAE(β=-0.120，P=0.020)和CRVE(β=-0.147，P=0.006)的危險(xiǎn)因素，即Hcy每增加一個(gè)單位，CRAE下降幅度為0.120 μm，CRVE下降幅度為0.147 μm；同時(shí)可見，年齡和SBP是CRAE的危險(xiǎn)因素，性別是CRAE的保護(hù)因素；年齡、HDL-C、LDL-C和hsCRP均是CRVE的危險(xiǎn)因素；BMI、收縮壓是AVR的危險(xiǎn)因素，性別則是保護(hù)因素。見表2、表3和表4。

表2 影響CRAE的多因素線性回歸分析

注：a調(diào)整R2=0.012；b調(diào)整R2=0.070；c調(diào)整R2=0.087

表3 影響CRVE的多因素線性回歸分析

注：a調(diào)整R2=0.007；b調(diào)整R2=0.053；c調(diào)整R2=0.061

表4 影響AVR的多因素線性回歸分析

注：a調(diào)整R2=0.002；b調(diào)整R2=0.014；c調(diào)整R2=0.042

2.4 影響AVR的多因素Logistic回歸分析正常AVR約為2/3，故將AVR<0.67及≥0.67分為兩組，模型以AVR分組為因變量，以Hcy四分位分組為自變量，同時(shí)校正多種因素，以第一分位組為對(duì)照，采用Logistic回歸分析Hcy對(duì)AVR分組的影響，結(jié)果顯示，同第一分位組相比，第二分位組、第三分位組、第四分位組均不是AVR的危險(xiǎn)因素(均為P>0.05)，OR值分別為0.985(95%CI為0.757～1.283)、1.094(95%CI為0.851～1.407)和1.046(95%CI為0.815～1.343)。見表5。

表5 影響AVR的多因素Logistic回歸分析

2.5 性別分層計(jì)算影響CRAE、CRVE、AVR的多因素線性回歸分析因?yàn)樾詣e與Hcy存在交互作用，故而將性別進(jìn)一步分層，分別以CRAE、CRVE和AVR作為因變量，Hcy測(cè)量值作為自變量，同時(shí)校正多種因素后，采用線性回歸分析在性別分層情況下Hcy對(duì)CRAE、CRVE和AVR的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男性中，Hcy是CRAE(β=-0.132，P=0.035)和CRVE (β=-0.136，P=0.048)的危險(xiǎn)因素，在女性中，Hcy對(duì)CRAE和CRVE的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Hcy與AVR在男女人群中均未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的明顯影響。

3 討論

Hcy是各種CVD的危險(xiǎn)因素，可以影響血管內(nèi)皮產(chǎn)生的NO生物利用度，從而加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的危險(xiǎn)性增加，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而形成慢性炎癥、血栓形成，造成血管管腔狹小及粥樣硬化[11]。視網(wǎng)膜微血管與腦部微血管在形態(tài)和生理上具有很多相同特性，被證實(shí)與體內(nèi)心臟、肺臟和腦部的微血管具有同源結(jié)構(gòu)[12]。有研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜血管微循環(huán)結(jié)構(gòu)的改變與心腦微循環(huán)疾病，如高血壓[13]、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、阿爾茲海默等疾病有密切相關(guān)性，是心腦血管事件重要的觀測(cè)因子。同時(shí)，視網(wǎng)膜血管直徑在其他全身性血管性疾病中，如精索靜脈曲張和腎臟疾病中也被發(fā)現(xiàn)有明顯的改變和評(píng)估作用[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy與CRAE(r=-0.125，P<0.001)、CRVE(r=-0.093，P<0.001)和AVR(r=-0.050，P=0.004)均有相關(guān)性。將Hcy分別和CRAE、CRVE和AVR進(jìn)行多因素線性回歸分析，結(jié)果顯示，Hcy是CRAE(β=-0.292)和CRVE(β=-0.241)的危險(xiǎn)因素(均為P<0.05)，在逐步校正了心腦血管多種混雜因素后，這種影響關(guān)系仍然存在(CRAE：β=-0.120，CRVE：β=-0.147，均為P<0.05)。而在矯正了心腦危險(xiǎn)因素后，Hcy對(duì)AVR的影響則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們分析可能原因?yàn)锳VR為CRAE與CRVE的比值，在CRAE和CRVE的值同時(shí)隨著Hcy的增加而減小的時(shí)候，幅度相近，比值變化不明顯，進(jìn)一步將AVR轉(zhuǎn)化為分類變量進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)Hcy并不是AVR的危險(xiǎn)因素，即隨著血漿中Hcy的含量增加，視網(wǎng)膜血管的動(dòng)靜脈直徑均呈減小的趨勢(shì)，且趨勢(shì)相近，AVR未見影響。這與既往研究不盡相同，Gopinath等[15]在Blue Mountains Eye Study對(duì)2334名(≥49歲)人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，整體人群中Hcy和血管直徑未見關(guān)聯(lián)，而Hecke等[16]在Hoorn Study對(duì)256名(年齡60～85歲)人群進(jìn)行研究，在矯正了年齡、性別和糖耐量后發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy增高CRAE出現(xiàn)和CRVE均減小，但是只有CRAE的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Omae等[17]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和明顯的蛋白激酶信號(hào)通路均參與Hcy介導(dǎo)的效應(yīng)，Hcy通過介導(dǎo)與P38激酶相關(guān)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NAD(P)H oxidase)產(chǎn)生過氧化物，從而影響依賴NO介導(dǎo)的血管內(nèi)皮反應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜小動(dòng)脈擴(kuò)張，或許可以從生理學(xué)角度解釋本研究中隨著Hcy的增高、CRAE減小的現(xiàn)象。同時(shí)如前所述，在既往的心腦血管研究中發(fā)現(xiàn)，Hcy影響依賴于NO的血管內(nèi)皮，可以造成血管的管腔狹窄，眼底血管與心腦血管具有同源結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy的增高，CRVE減小，推測(cè)視網(wǎng)膜小靜脈發(fā)生了和心腦等全身血管相同的生理反應(yīng)。

我們的研究在帶入心腦血管因素行多因素分析發(fā)現(xiàn)，CRAE與年齡、性別和血壓的關(guān)系亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CRVE與年齡、HDL-C、LDL-C和CRP的關(guān)系亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與既往研究大致相同[16]。我們將性別進(jìn)一步分層發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy的增高，CRAE和CRVE減小的現(xiàn)象只存在于男性而不是女性人群，Gopinath等[15]將性別分層進(jìn)行多因素線性回歸分析，同時(shí)在調(diào)整了年齡、血壓、吸煙、糖尿病、葉酸和維生素B12水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，只在男性人群中發(fā)現(xiàn)Hcy與CRAE有相關(guān)性，是其危險(xiǎn)因素；但是同樣的結(jié)果在CRVE中卻未發(fā)現(xiàn)，這與我們的結(jié)果有相似之處，但是性別因素在Hcy和眼底血管直徑中的關(guān)系中所起的影響還需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了我國(guó)北方人群中視網(wǎng)膜小動(dòng)脈和小靜脈的狹窄均與血漿中Hcy水平的升高有關(guān)聯(lián)，而這種關(guān)聯(lián)似乎只存在于男性人群中，需要進(jìn)一步進(jìn)行前瞻性研究來驗(yàn)證性別差異，并確認(rèn)Hcy與視網(wǎng)膜小血管直徑之間實(shí)時(shí)的關(guān)系。本發(fā)現(xiàn)為Hcy可能會(huì)影響全身微循環(huán)提供了更進(jìn)一步的證據(jù)，同時(shí)眼底血管直徑的變化可以和Hcy一起作為心腦血管事件的監(jiān)控和預(yù)測(cè)因子。