糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清miRNA的臨床價(jià)值△

代寶珠 代艷

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是目前成年人(20～65歲)視力下降和失明的主要原因[1]。由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管和視網(wǎng)膜色素上皮組成的血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)能夠阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)因子和循環(huán)炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞毒性產(chǎn)物的進(jìn)入，從而保護(hù)和允許視網(wǎng)膜調(diào)節(jié)細(xì)胞外化學(xué)物質(zhì)成分[2]。長期的高血糖對視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)造成的損害是導(dǎo)致BRB失衡的關(guān)鍵。BRB失衡進(jìn)而使血管內(nèi)液體和脂質(zhì)等物質(zhì)滲漏到視網(wǎng)膜，并加重DR的進(jìn)展[3]。DR的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素作用過程，已有研究證實(shí)，許多與高血糖發(fā)病相關(guān)途徑的蛋白編碼基因參與其中[4]。近年有研究發(fā)現(xiàn)[5]，大量的非編碼RNA在DR的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，其中微小RNA(microRNA，即miRNA)尤其受到關(guān)注。miRNA是一組短的(21～23個(gè)核苷酸)、高度保守的內(nèi)源RNA，不編碼蛋白質(zhì)[6]，但可通過與靶基因的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)的配對結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制蛋白翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[6]。已有研究表明[7]，miRNA參與視網(wǎng)膜細(xì)胞的增生、遷移和凋亡以及與DR相關(guān)的新生血管形成過程。同時(shí)，DR患者血清中也存在著miRNA-451、miRNA-221、miRNA-200b的異常表達(dá)[8]。然而，其在DR患者中的臨床意義尚未完全清楚，基于此進(jìn)行了以下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至12月在本院內(nèi)分泌科住院治療的單純2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者60例及眼科住院治療的DR患者60例(非增生型DR 54例，增生型DR 6例)納入本研究。DM組患者均符合世界衛(wèi)生組織制定的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：DR組患者經(jīng)裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡及熒光素眼底血管造影檢查，符合DR臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腫瘤及內(nèi)分泌疾病者、急慢性感染者、嚴(yán)重肝腎功能不全者，合并白內(nèi)障、青光眼等其他眼部疾病者，孕婦及哺乳期女性。DM組患者中，男29例，女31例；年齡35～81(63.5±10.1)歲；DM病程10～25(10.9±11.5)a。DR組患者中，男32例，女28例；年齡40～85(65.2±10.3)歲；DM病程10～25(15.4±10.2)a。DM組和DR組間男女構(gòu)成比、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批并獲取所有受檢者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集所有受檢者禁食8 h后抽取受檢者靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4 ℃、3000 r·min-1離心15 min，血清通過全自動生化分析儀(美思康 MC6600)檢測患者空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、肌酐(creatinine，Cr)及血尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)，比濁法檢測尿白蛋白/肌酐(urinary albumin/creatinine，UACR)、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbAlc)，所用試劑盒均購自北京原子高科股份有限公司，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.2 miRNA提取本研究選用miRNA Purification Kit試劑盒(康為世紀(jì))進(jìn)行提取。室溫下解凍血清樣品，取200 μL血清樣品，加入5倍體積TRizon Reagent反復(fù)吹打，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離，離心5 min，取上層無水相于離心管中，加入1/3無水乙醇，過柱，洗柱2次。向吸附柱RS中加入700 μL Buffer RWT離心后倒掉廢液，重新將吸附柱RS(Spin Columns)中加入500 μL Buffer RWT離心后倒掉廢液，重復(fù)2次，向得到的吸附柱中間部位加入30～50 μL RNase-Free Water，離心后將收集到的RNA液保存至-80 ℃冰箱。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測根據(jù)miRNA cDNA Sythesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測。RT-PCR儀(Bio-Rad伯樂T100)擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，56 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)計(jì)miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物和RT-PCR擴(kuò)增序列(5’-3’)(PCR檢測時(shí)上下游引物成對)引物見表1，miRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct表示。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

表1 引物信息

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Pearson法分析miRNA與血清生化指標(biāo)之間的相關(guān)性，多因素Logistic回歸分析DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素，ROC曲線分析miRNA對DR的診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清臨床生化指標(biāo)比較DM與DR兩組間的血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，兩組間 TC、LDL-C、TG、Cr 及 BUN水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，而DR組UACR、HbAlc 及 FPG均明顯高于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者血清臨床生化指標(biāo)比較

2.2 兩組患者血清中3種miRNA表達(dá)水平比較3種血清miRNA的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，DM組中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b水平均明顯低于DR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組血清中3種miRNA表達(dá)水平比較。A：miRNA-451相對表達(dá)量；B：miR-221相對表達(dá)量；C：miR-200b相對表達(dá)量

2.3 血清中3種miRNA與生化指標(biāo)的相關(guān)性Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DR 組患者血清各miRNA與UACR、HbAlc及FPG均呈正相關(guān)(均為P<0.05)，miRNA-451與miRNA-221(r=0.402，P=0.022)、miRNA-200b(r=0.768，P<0.01)，以及miRNA-221與miRNA-200b之間(r=0.698，P<0.01)相互呈正相關(guān)關(guān)系。見表3。

表3 血清中3種miRNA與生化指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 多因素Logistic回歸分析DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素對兩組患者血清生化指標(biāo)和miRNA進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，UACR、HbAlc、FPG、miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b是DR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素

2.5 血清中3種miRNA及三項(xiàng)聯(lián)合對DR的診斷價(jià)值對miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積分別為0.722、0.823及0.761，具有較高的診斷價(jià)值。以各miRNA為自變量建立Logistic回歸模型，y=-12.066 8+1.460 85X1+1.387 97X2+0.332 92X3，X1=miRNA-451,X2=miRNA-221,X3=miRNA-200b，曲線下面積為0.938，大于單一檢測任一miRNA的曲線下面積。見表5。

表5 3種miRNA及三項(xiàng)聯(lián)合對DR的診斷價(jià)值

3 討論

DR最主要的特征是高血糖損害視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)，導(dǎo)致代償性新生血管化[11]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，小型非編碼RNA分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞等的信號通路調(diào)節(jié)中起著重要的作用[12]。在DR患者視網(wǎng)膜中已發(fā)現(xiàn)有超過80種小分子RNA表達(dá)異常升高，6種表達(dá)下調(diào)，且部分被證實(shí)與DR發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性[13]。小分子RNA可通過調(diào)節(jié)miRNA和蛋白質(zhì)水平上的基因表達(dá)，以增強(qiáng)細(xì)胞死亡和減少血管內(nèi)皮增生來調(diào)控血管的生成[14]。因此，在DR的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在著一種或多種特殊的血清miRNA表達(dá)模式，可以作為一種新的非侵入性方法來早期預(yù)測DR。

本研究結(jié)果顯示，DR組中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b較DM組明顯升高，說明這3種miRNA在DR組患者血清中異常高表達(dá)，可能與視網(wǎng)膜病變存在相關(guān)性。已有研究認(rèn)為[15]，在高糖微環(huán)境下，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中miRNA-451表達(dá)異常升高。在本研究中，DR組患者血清中FPG明顯高于DM組，與此結(jié)果相符。而通過RF/6A細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)[16]，下調(diào)miRNA-451水平后，細(xì)胞遷移明顯下降，使由遷移行為介導(dǎo)的管腔形成能力受到抑制，從而阻礙增生膜的形成，說明下調(diào)miRNA-451表達(dá)對降低DR的發(fā)生率有利。另有研究發(fā)現(xiàn)[17]，miRNA-221通過在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)來發(fā)揮抗增生、抗遷移和促凋亡作用。miRNA-221主要影響c-kit(即干細(xì)胞因子受體)，其在內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和歸巢中起著關(guān)鍵作用，內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，又稱為成血管細(xì)胞。在高血糖的環(huán)境下，miRNA-221是在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)的，它能有效地觸發(fā)對c-kit的抑制和對HUVEC遷移的損害[18]。因此，在DR患者的血管內(nèi)皮生成方面起抑制作用。此外，miRNA-200b過度表達(dá)下調(diào)抗氧化基因，該基因具有保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞抵抗凋亡和氧化應(yīng)激的作用。氧化應(yīng)激的增加可導(dǎo)致氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子的激活，進(jìn)而改變包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內(nèi)的許多基因的表達(dá)[19]。Li等[20]報(bào)道，miRNA-200b和VEGF之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這也從另一個(gè)側(cè)面證明VEGF可能是miRNA-200b的靶基因。因此，miRNA可能在DR的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，檢測 miRNA-451、miRNA-221及 miRNA-200b在血清中的表達(dá)水平，有助于對DR發(fā)病機(jī)制的研究，并為靶向干預(yù)治療提供新的策略。

本研究還發(fā)現(xiàn)，UACR、HbAlc、FPG、miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b是DR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且各miRNA分別與UACR、HbAlc、FPG之間呈正相關(guān)關(guān)系，三者之間也呈正相關(guān)關(guān)系，提示這3種miRNA可能與DR發(fā)生發(fā)展及其微血管病變密切相關(guān)。因此，miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b水平顯著上調(diào)可能是DR病情加重的早期信號，應(yīng)引起臨床重視，盡早采取有效的措施控制病情進(jìn)展。本研究中3種miRNA ROC曲線分析結(jié)果表明，三者聯(lián)合檢測的評估價(jià)值優(yōu)于單項(xiàng)miRNA檢測。

綜上所述，DR患者存在著血清中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b的異常高表達(dá)，這些miRNA可能參與了DR的發(fā)生發(fā)展過程。因此，血清中miRNA-451、miRNA-221及miRNA-200b檢測可以作為DM患者向DR發(fā)展的一種新的非侵入性風(fēng)險(xiǎn)評估生物學(xué)指標(biāo)，有望為DR的早期預(yù)防和早期診斷提供新的研究方向。