吳躍開(kāi) 歐國(guó)騰

摘要：麻風(fēng)樹(shù)芽枯病是貴州省境內(nèi)麻風(fēng)樹(shù)人工林中最常見(jiàn)、最重要的病害種類之一，其癥狀主要表現(xiàn)為葉芽不能萌發(fā)，或剛萌發(fā)即枯死，導(dǎo)致病株出現(xiàn)大量“光稈”枝條，且在病害發(fā)展后期整個(gè)枝條枯死。通過(guò)一系列研究，包括病菌的分離培養(yǎng)、致病性接種、形態(tài)特征觀測(cè)以及rDNA-ITS序列分析，證實(shí)引起該病的病原菌為小新殼梭孢[Neofusicoccum parvum （Pennycook & Samuels） Crous，Slippers & A.J.L Phillips]。由該病原菌引起的麻風(fēng)樹(shù)芽枯病在國(guó)內(nèi)外均系首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞：麻風(fēng)樹(shù);芽枯病;病原;小新殼梭孢

中圖分類號(hào)： S763.15 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0085-03

作為新興的能源樹(shù)種，麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas L.）在近年來(lái)得到廣泛重視，目前在國(guó)內(nèi)外氣候適宜的地區(qū)均有大面積的種植[1];與此同時(shí)，人工林的大面積建設(shè)導(dǎo)致麻風(fēng)樹(shù)病蟲害問(wèn)題十分突出。根據(jù)連續(xù)幾年的野外調(diào)查結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)許多麻風(fēng)樹(shù)植株在每年的生長(zhǎng)季節(jié)中，存在許多“光稈”枝條，系枝條上葉芽受到病菌感染而失去活力、不能正常萌發(fā)生長(zhǎng)所致，因而稱之為芽枯病。該病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致大量枝條不能萌發(fā)且在病害發(fā)展后期整個(gè)枝條枯死，直接導(dǎo)致麻風(fēng)樹(shù)能源林分的生產(chǎn)力及其果實(shí)產(chǎn)量受損嚴(yán)重，從而成為麻風(fēng)樹(shù)上最重要病害種類之一。然而，迄今為止，這一特殊的病害類型及其致病病原在國(guó)內(nèi)、國(guó)外均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，更無(wú)從談及對(duì)于該病的有效防治。鑒于此，本研究對(duì)該病的發(fā)病特點(diǎn)及其致病病原物進(jìn)行初步研究，以期為將來(lái)的病害流行學(xué)研究及其科學(xué)防控技術(shù)研究提供必要的基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

病害調(diào)查時(shí)間為2014年5月中旬，所調(diào)查麻風(fēng)樹(shù)林分位于貴州省羅甸縣茂井鎮(zhèn)高里村，為丘陵山地的中上坡位，主要坡向?yàn)槟匣蛭髂?，海拔范圍?80～550 m。調(diào)查代表面積 10 hm2，所栽麻風(fēng)樹(shù)為7～8年生中幼林。病害調(diào)查內(nèi)容主要包括發(fā)病時(shí)間、發(fā)病癥狀、受害株率、危害程度、危害后果等。

1.2 病害采樣及分離培養(yǎng)

采集具有典型芽枯癥狀的病枝，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。對(duì)采集到的病害標(biāo)本盡快實(shí)施病菌分離操作，分離部位包括枯芽部位的病健交界組織、病部中間組織以及芽眼病斑上的病菌子實(shí)體。分離前先將病枝截成小段，用自來(lái)水沖洗干凈，然后用無(wú)水乙醇擦洗消毒（重點(diǎn)處理芽眼病部），用乙醇燈火焰蘸燒，然后用消毒的刀片切開(kāi)，用接種針挑取相應(yīng)的病部組織迅速轉(zhuǎn)置于試管中的培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分離培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)出的培養(yǎng)物各通過(guò)2次轉(zhuǎn)管進(jìn)行純化，最終將所獲培養(yǎng)物（菌株）按采集地點(diǎn)、采集時(shí)間及標(biāo)本號(hào)進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)，于 4 ℃ 冰箱內(nèi)保藏備用。

1.3 致病性接種試驗(yàn)

試驗(yàn)時(shí)間為2015年4月上旬。向純化的試管菌種中加入無(wú)菌水并攪勻以制成菌體懸浮液或直接用病菌子實(shí)體制作孢子懸浮液。供試麻風(fēng)樹(shù)苗選用健康無(wú)病的2年生容器實(shí)生苗，接種時(shí)用毛筆蘸菌液涂抹整個(gè)莖部，共處理10株;另選10株直接涂抹無(wú)菌水作為對(duì)照。用塑料薄膜包裹接種部位以保濕（同時(shí)避免其他病菌感染）。將各試驗(yàn)苗置于人工小溫棚內(nèi)，棚內(nèi)溫度為20～30 ℃。涂菌處理與對(duì)照處理的苗木要間隔一段距離以避免交叉感染。1周后開(kāi)始觀察發(fā)病情況。最后，從病菌接種后形成的病斑上再次分離培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)特征的觀測(cè)確定分離到的菌株與接種菌株是否為同一種。

1.4 病原菌形態(tài)特征觀測(cè)

對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生子實(shí)體的標(biāo)本，可直接進(jìn)行徒手切片，在顯微鏡下觀測(cè)記錄子實(shí)體結(jié)構(gòu)、大小，以及其中孢子的形態(tài)特征。對(duì)人工分離物進(jìn)行鏡檢時(shí)，鏡檢內(nèi)容包括菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顏色，分生孢子形態(tài)、大小、顏色，以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形態(tài)等特征。

1.5 分子生物學(xué)研究

將獲得的純培養(yǎng)菌落委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行核糖體RNA（rRNA）基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的序列測(cè)定。依據(jù)ITS序列，采用MEGA 4.0中的鄰接法（neighbor-joining method，簡(jiǎn)稱N-J法）進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建，并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行1 000次可信度分析。

1.6 病原的分類鑒定

根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合分子生物學(xué)研究結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)病原物進(jìn)行分類鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害危害情況

芽枯病在所調(diào)查的麻風(fēng)樹(shù)林分中普遍發(fā)生，感病株率達(dá)73%（n=100）。在受害植株中，感病枝條數(shù)為1～3根的占24%，4～6根的占35%，6根以上的占41%。病害的發(fā)生導(dǎo)致許多麻風(fēng)樹(shù)植株的大量枝條不能萌發(fā)而呈光稈狀，最終干枯死亡，癥狀十分顯眼;該病的發(fā)生對(duì)麻風(fēng)樹(shù)的正常生長(zhǎng)及林分產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。從發(fā)病率、危害后果方面看，該病害可被列為貴州麻風(fēng)樹(shù)的頭號(hào)危險(xiǎn)性有害生物。

2.2 病癥特點(diǎn)

每年春末夏初，當(dāng)麻風(fēng)樹(shù)樹(shù)液開(kāi)始流動(dòng)時(shí)，病菌即開(kāi)始其侵染進(jìn)程;病菌主要從芽眼部位入侵，導(dǎo)致芽位組織變色腐爛，流出紅褐色汁液，嫩芽變褐枯死;隨后，圍繞芽眼形成灰白色病斑并逐漸擴(kuò)大，病斑上可見(jiàn)生長(zhǎng)許多黑色顆粒狀物（為病菌的子實(shí)體）。在一般情況下，受害枝條上的大多數(shù)芽會(huì)同時(shí)受到侵染危害，感病的芽均不能正常萌發(fā)，或剛萌發(fā)即枯死，結(jié)果導(dǎo)致整個(gè)枝條呈光稈狀，最終整個(gè)枝條枯死（圖1-a～ 圖1-d）。5—7月是該病的發(fā)病盛期。

需要說(shuō)明的是，該病菌除了主要侵染芽眼外，也可以侵染枝干上的其他部位，形成典型的潰瘍下陷斑，在這種情況下，該病易與由七葉樹(shù)殼梭孢（Fusicoccum aesculi）引起的枝干潰瘍病[2]混淆。事實(shí)上，這2種病害在麻風(fēng)樹(shù)林分中常?；旌习l(fā)生危害。

2.3 病原形態(tài)特征

在人工PDA培養(yǎng)基上，由各部位分離培養(yǎng)形成的菌落特征相似。菌落初為白色、緊密，后變?yōu)榛疑?，直至呈暗灰色，一般不易形成明顯的子實(shí)體（圖1-e）。

基于病斑上自然形成的子實(shí)體的解剖觀測(cè)結(jié)果如下：分生孢子殼單生或幾個(gè)呈單層聚生于子座內(nèi)，后期突破寄主表皮;

分生孢子殼呈球形，直徑為150～200 μm（n=20），有或無(wú)乳突，殼壁由暗褐色厚壁細(xì)胞組成，使其呈暗褐色或黑色;分生孢子梗成層著生于整個(gè)內(nèi)部殼壁上;分生孢子呈淡橄欖色，長(zhǎng)橢圓、擬鞋底形，無(wú)隔，一端鈍園，另一端稍顯平截，大小為（4.7～7.9） μm×（12.86～22.04） μm（n=20）。子囊殼的大小、形狀與結(jié)構(gòu)與分子孢子殼相似，不易區(qū)分。子囊具雙囊壁，棍棒形，大小為（18～24） μm×（82～155） μm，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子，子囊孢子呈卵圓形、寬橢圓形，大小為（8.35～12.16） μm×（17.45～20.56） μm（n=20），詳見(jiàn)圖1-f～圖1-m。

2.4 致病性接種試驗(yàn)

由于人工培養(yǎng)菌落不易產(chǎn)孢，病菌懸浮液直接由病斑上的子實(shí)體研磨加無(wú)菌水配制而成，其孢子濃度為1.6×105個(gè)/mL。接種后1周，大多數(shù)芽眼部位出現(xiàn)流汁現(xiàn)象，2周后，流汁現(xiàn)象更嚴(yán)重，有些剛剛冒出的新嫩芽出現(xiàn)變色枯萎;1個(gè)月后，在芽眼部位呈現(xiàn)明顯的病斑，直徑為2～5 cm。3個(gè)月后，病斑呈現(xiàn)灰白色，上面著生黑色顆粒狀物，與野外癥狀相似。對(duì)照處理的苗木均正常生長(zhǎng)發(fā)芽、展葉甚至抽枝。由病斑部位的顆粒狀物分離培養(yǎng)的菌落和接種菌的菌落形態(tài)特征一致，顆粒狀物解剖特征也與接種病原菌一致，從而驗(yàn)證了科赫法則。

2.5 分子檢測(cè)鑒定

通過(guò)多次分離純化，獲得代表性病原菌株MY01。以MY01菌株DNA為模板，利用常用引物ITS1（5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）及ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）為探針擴(kuò)增ITS序列。圖2是該病菌的ITS序列。

將該DNA序列在NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）網(wǎng)站的GenBank上利用BLASTN模塊進(jìn)行BLAST，對(duì)MY01的ITS序列進(jìn)行同源性分析。根據(jù)BLAST結(jié)果，該菌株與JN222970[小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）]的同源性達(dá)100%，詳見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)以上研究結(jié)果，證實(shí)引起麻風(fēng)樹(shù)芽枯病的病原菌為小新殼梭孢[Neofusicoccum parvum （Pennycook & Samuels） Crous，Slippers & A.J.L Phillips]，在現(xiàn)代分類系統(tǒng)中屬于子囊菌門（Ascomycota）座囊菌綱（Dothideomycetes）葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）新殼梭孢屬（Neofusicoccum），其有性型為葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva Pennycook & Samuels）。有研究表明，該菌為世界廣布種，且寄主范圍十分廣泛，是許多植物的重要病原菌[3]。其中，國(guó)內(nèi)報(bào)道該菌可侵染危害藍(lán)莓、核桃、毛葡萄、桉樹(shù)、柏木、油桐等[4-9]。然而，迄今為止，國(guó)內(nèi)外均未有關(guān)于該菌侵染危害麻風(fēng)樹(shù)并引起嚴(yán)重芽枯病的報(bào)道。

小新殼梭孢在系統(tǒng)發(fā)育上與同屬的N. ribis比較相近，它們?cè)谛螒B(tài)上十分相似，容易混淆，相互之間的區(qū)別必須依據(jù)rDNA-ITS和EF-1a基因序列分析[3]。同時(shí)值得一提的是，N. parvum自身的種內(nèi)遺傳多樣性很高，使得系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果為同一種的不同菌株間在菌落特征、形態(tài)特征等方面卻存在一定變異[10]。這也可能是不同研究對(duì)N. parvum的形態(tài)描述存在差異的原因。

研究表明，小新殼梭孢對(duì)麻風(fēng)樹(shù)的致病性極強(qiáng)，一旦發(fā)現(xiàn)植株感病，往往為時(shí)已晚。因此，對(duì)該病的防治應(yīng)該以預(yù)防為主，即加強(qiáng)林分的水肥管理，提高樹(shù)木生長(zhǎng)勢(shì)，必要時(shí)輔以預(yù)防性噴藥處理;發(fā)病初期及早噴藥處理也可以獲得一定的療效;發(fā)病晚期則應(yīng)該將感病枝、感病梢修剪掉，連同病死株集中銷毀，最大可能地剔除傳染源。對(duì)病株周邊的健康植株，在秋季落葉或春季萌發(fā)前噴施化學(xué)保護(hù)劑可以起到一定的預(yù)防作用。當(dāng)然，下一步要加大對(duì)病原菌的生物及生態(tài)學(xué)特性的深入研究，切實(shí)掌握麻風(fēng)樹(shù)芽枯病的病害流行學(xué)特點(diǎn)，通過(guò)多方面的試驗(yàn)掌握科學(xué)可靠的綜合防控措施。

參考文獻(xiàn)：

[1]王海波，郭俊云，劉 潮，等. 麻風(fēng)樹(shù)脂肪酸去飽和酶7基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（2）：31-35.

[2]吳躍開(kāi)，歐國(guó)騰，孫建昌. 麻風(fēng)樹(shù)枝干潰瘍病的病原鑒定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（3）：518-521.

[3]Phillips A J L，Alves A，Abdollahzadeh J，et al. The Botryosphaeriaceae：genera and species known from culture[J]. Studies in Mycology，2013，76（1）：51-167.

[4]徐成楠，遲福梅，冀志蕊，等. 5種殺菌劑對(duì)藍(lán)莓枝枯病菌（Neofusicoccum parvum）的毒力測(cè)定及對(duì)病害的防效研究[J]. 中國(guó)果樹(shù)，2016（3）：42-46.

[5]尹萬(wàn)瑞，朱天輝. 核桃枝枯病病原菌生物學(xué)特性及藥劑防治[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，44（7）：98-101.

[6]吳代東，付 崗，葉云峰，等. 毛葡萄穗軸潰瘍病病原鑒定及防治藥劑初步篩選[J]. 植物保護(hù)，2016，42（1）：203-207.

[7]廖旺姣，鄒東霞，薛振南，等. 桉樹(shù)小新殼梭孢梢枯病菌室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定[J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2014，28（4）：116-118.

[8]李淑斌，張 顥. 柏木枯萎病病原菌的形態(tài)特征及分子鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（增刊2）：190-192.

[9]袁志林，陳益存，汪陽(yáng)東. 一種新發(fā)生的油桐葉枯病病原真菌[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2011，30（4）：658-662.

[10]Abdollahzadeh J，Javadi A，Zare R，et al. Phylogeny and taxonomy of Botryosphaeria and Neofusicoccum species in Iran，with description of Botryosphaeria scharifii sp.nov.[J]. Mycologia，2013，105（1）：210-220. 龐 磊，吳 亮，譚秀梅，等. 園林綠地金龜子生物防治研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：88-90.