禽畜糞便中抗生素耐藥菌的分離與分子鑒定

劉偉杰 賀小娜 韓珊珊

摘要：近年來，各種抗生素在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中被大量濫用，導(dǎo)致抗生素耐藥菌大量產(chǎn)生，嚴重危害生態(tài)環(huán)境和人體健康。通過對4個不同地區(qū)禽畜糞便中的抗生素耐藥菌進行分離，共分離到17株不同的耐藥菌，其中12株可以耐受2種及以上的抗生素。通過16S rRNA序列比對分析確定了耐藥菌株的種屬地位，對于了解喂食抗生素禽畜糞便中常見的耐藥菌具有一定的理論指導(dǎo)意義，同時也為含有抗生素廢水的治理積累了菌種資源。

關(guān)鍵詞：禽畜糞便;抗生素;耐受性;分離;分子鑒定

中圖分類號： S852.6 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0291-03

我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，每年生產(chǎn)抗生素20萬t，其中有40%左右被用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)，尤其在雞、鴨、豬的養(yǎng)殖中使用更為嚴重[1-2]。常見的抗生素如四環(huán)素、氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素等可以有效殺滅病原菌，在短時間內(nèi)可以減少畜牧養(yǎng)殖業(yè)因病原菌引起的經(jīng)濟損失[3]。然而，隨著我國規(guī)模化、集約式畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，抗生素的使用量急劇增加。養(yǎng)殖戶為了追逐經(jīng)濟利益，濫用抗生素，使得大部分抗生素未被利用便隨糞便和尿液排出體外，造成動物糞便中抗生素含量嚴重超標(biāo)[4]，因此，在畜禽糞便中產(chǎn)生了大量的抗生素耐藥微生物[2，5]，甚至是超級細菌。

在我國，越來越多的禽畜糞便被資源化處理，制成有機肥被施用在農(nóng)田土壤中。糞便中含有的耐藥微生物所攜帶的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等成為抗性基因轉(zhuǎn)移和傳播的主要因素，這些耐藥微生物可以通過直接或者間接接觸（如食物鏈）等途徑進入人體，從而給人類公共健康帶來威脅[6-7]。耐藥微生物和耐藥基因已經(jīng)成為新型的污染源，引起人們的廣泛關(guān)注，然而目前對禽畜養(yǎng)殖糞便中常見耐藥菌的研究還較少。

本研究從江蘇不同地區(qū)的養(yǎng)殖場采集了4個禽畜糞便樣品，分別為無錫市宜興養(yǎng)鴨場糞便、徐州市沛縣養(yǎng)鴨場糞便、徐州市沛縣養(yǎng)雞場糞便、徐州市豐縣養(yǎng)鴨場糞便。通過耐藥菌的分離純化共篩選到17株不同的耐藥菌株，并對所獲得的菌株進行了多重抗生素耐藥菌分析。在此基礎(chǔ)上，利用16S rRNA分子生物學(xué)技術(shù)分析了所獲得的耐藥菌株的種屬地位。本研究對于了解禽畜糞便中常見的耐藥微生物、指導(dǎo)抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的合理使用具有很好的理論意義，同時也為抗生素廢水和抗生素污染土壤的修復(fù)提供了菌種資源。

1 材料與方法

1.1 禽畜糞便的來源與采集

禽畜糞便樣品分別采集于江蘇省無錫市宜興養(yǎng)鴨場、徐州市沛縣養(yǎng)鴨場、徐州市沛縣養(yǎng)雞場、徐州市豐縣養(yǎng)鴨場。采集糞便樣品后，迅速帶回實驗室于4 ℃保藏，并及時進行菌種分離。

1.2 分離培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉，20 g/L瓊脂，于115 ℃滅菌30 min。滅菌后待溫度降至55 ℃左右，加入相應(yīng)的抗生素后倒平板。抗生素的使用濃度為其常用的抑菌濃度：50 mg/L卡那霉素，20 mg/L四環(huán)素，50 mg/L 氨芐青霉素，50 mg/L紅霉素，50 mg/L慶大霉素。

1.3 抗生素耐藥菌的分離

分別取4個禽畜糞便樣品各1 g，加入9 mL 0.9% NaCl溶液中，利用渦旋振蕩器充分混勻。靜置5 min后，取0.1 mL上層液體均勻涂布于含有不同抗生素的固體培養(yǎng)基平板上（以沒有抗性的Escherichia coli DH5α作為陰性對照，涂布于抗性平板上以驗證抗性平板的有效性），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后，從形態(tài)學(xué)上排除從同一樣品中分離獲得的相同菌株，然后從平板上挑取單菌落在同種抗生素培養(yǎng)基平板上進行四區(qū)劃線純化，將純化后的單菌落接種于含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h驗證其耐藥性。將獲得的純種耐藥菌株發(fā)酵液與30%甘油等體積比混合后，保藏于-80 ℃冰箱中待用。

1.4 菌株的多重抗生素耐受性分析

將分離得到的17株抗生素耐受菌株進行多重抗生素耐受性分析。將純化好的菌株進行活化培養(yǎng)，然后涂布在不同的抗生素平板上（分別含50 mg/L卡那霉素、20 mg/L四環(huán)素、50 mg/L氨芐青霉素、50 mg/L紅霉素、50 mg/L慶大霉素），檢測其耐受性，若生長，即為耐受，若不生長，即為不耐受，統(tǒng)計菌株對抗生素的多重耐藥性。

1.5 抗生素耐藥菌的分子鑒定

將分離獲得的17株耐藥菌株接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，搖瓶過夜培養(yǎng)。于10 000 r/min、4 ℃離心收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌株的基因組DNA。以提取獲得的基因組DNA作為模板，分別擴增菌株的16S rRNA序列。用于PCR擴增的上下游引物分別為5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR反應(yīng)體系的總體積為50 μL，在0.2 mL Eppendorf管中依次加入5 μL 10×buffer、1 μL dNTP、1 μL正向引物、1 μL反向引物、1 μL模板DNA、0.5 μL DNA聚合酶，加ddH2O補足總體積至 50 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。將擴增獲得的16S rRNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]純化后，交北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。將測得的16S rRNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，確定耐藥菌株的種屬地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素耐受菌株的分離

本研究利用含有常用抑菌濃度的卡那霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、紅霉素、慶大霉素的平板分離禽畜糞便中的耐藥菌株。如表1所示，從4份禽畜糞便樣品中共分離獲得17株不同種屬的抗生素耐藥菌株，其中從無錫市宜興養(yǎng)鴨場分離到5株，從徐州市沛縣養(yǎng)鴨場分離到4株，從徐州市沛縣養(yǎng)雞場分離到4株，從徐州市豐縣養(yǎng)鴨場分離到4株。4個樣品中的耐藥菌都以耐受四環(huán)素為主，這一趨勢符合當(dāng)前四環(huán)素被大量用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)狀。四環(huán)素是在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中實際使用量最大的抗生素[8-9]，在抗生素的選擇性壓力下，導(dǎo)致禽畜養(yǎng)殖糞便中四環(huán)素耐藥菌最多。

2.2 抗生素耐受菌株的分子生物學(xué)鑒定

對分離獲得的17株抗生素耐藥菌的16S rRNA基因進行PCR擴增和序列分析，將得到的序列結(jié)果通過與NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）數(shù)據(jù)庫中目前已報道的16S rRNA序列進行比對，確定耐藥菌種的種屬地位。如表2所示，從無錫宜興養(yǎng)鴨場糞便中分離到的5株抗生素耐藥菌分別為氣味類香菌（Myroides odoratus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）、吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）、堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）;從徐州沛縣養(yǎng)鴨場糞便中分離到的4株耐藥菌分別為漢氏鹽單胞菌（Halomonas hamiltonii）、腸球菌（Enterococcus eurekensis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、嗜氣芽孢桿菌（Bacillus aerophilus）;從徐州沛縣養(yǎng)雞場糞便中分離到的4株耐藥菌分別為副凝膠短狀桿菌（Brachybacterium paraconglomeratum）、尿道氣球菌（Aerococcus urinaeequi）、孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）;從徐州豐縣養(yǎng)鴨場中分離到的4株耐藥菌分別為酯香微桿菌（Microbacterium esteraromaticum）、 微桿菌（Microbacterium suwonense）、 玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.3 多重抗生素耐受菌株分析

如表2所示，從4個禽畜糞便樣品中分離到的17株耐藥菌中有4株可以耐受2種抗生素，3株可以耐受3種抗生素，4株可以耐受4種抗生素[分別為氣味類香菌（Myroides odoratus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）]，1株可以耐受5種抗生素，為糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）。多重抗生素耐藥菌的出現(xiàn)會導(dǎo)致抗生素失效，威脅禽畜養(yǎng)殖的安全，同時對環(huán)境與人類健康構(gòu)成嚴重威脅，因此應(yīng)采取措施積極引導(dǎo)和監(jiān)督養(yǎng)殖戶減少或避免使用抗生素。

3 討論

近年來，多種抗生素被添加到禽畜飼料中，用于防范養(yǎng)殖過程中病害的發(fā)生?？股氐拇笠?guī)模濫用導(dǎo)致抗生素耐藥菌問題惡化，而且出現(xiàn)了多重耐藥菌，甚至是超級細菌。耐藥菌的產(chǎn)生嚴重威脅著環(huán)境安全和人類健康[10]。耐藥菌導(dǎo)致抗生素效果減弱，如藥物使用劑量增大、抑菌過程延長、疾病復(fù)發(fā)率升高等，甚至?xí)箍股厥?，?dǎo)致禽畜或病人的死亡率升高。目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多株多重耐藥病菌，如糞腸球菌、肺炎分支桿菌和綠膿假單胞菌，因此可見耐藥菌的問題引起了人們的廣泛關(guān)注[11-12]。然而，目前對抗生素濫用導(dǎo)致禽畜糞便中耐藥菌形成情況的研究還較少。

本研究從4種禽畜糞便樣品中共分離獲得17株不同的耐藥菌，并分析了這些菌株對多重抗生素的耐受性。結(jié)果表明，在17株耐藥菌中有3株可以耐受3種抗生素;4株可以耐受4種抗生素，分別為氣味類香菌、大腸桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和孔氏葡萄球菌;1株可以耐受5種抗生素，為糞產(chǎn)堿桿菌。本研究新發(fā)現(xiàn)了多株多重耐藥菌，其中包括致病菌株，如氣味類香菌、大腸桿菌、葡萄球菌和糞產(chǎn)堿桿菌等，糞產(chǎn)堿桿菌可寄生在動物的腸腔中，可機會性致病，引起腸炎等。本研究對于指導(dǎo)禽畜養(yǎng)殖中合理使用抗生素具有一定的理論指導(dǎo)意義。

抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的長期濫用導(dǎo)致養(yǎng)殖動物糞便中耐藥菌株數(shù)增加，這些攜帶抗生素抗性基因的菌株是環(huán)境中抗生素抗性基因最重要的來源之一[5]。目前從世界上很多國家、地區(qū)的肉、牛奶等樣品中檢測到的腸球菌均攜帶抗生素抗性基因。雖然一些耐藥性菌株不具有致病性，卻能夠?qū)⒛退幓蛩睫D(zhuǎn)移給致病菌，因此嚴格控制禽畜養(yǎng)殖等領(lǐng)域的抗生素使用量迫在眉睫。

4 結(jié)論

本研究從4個地區(qū)的禽畜糞便樣品中共分離出17株不同的耐藥菌，其中有4株可以耐受2種抗生素，3株可以耐受3種抗生素，4株可以耐受4種抗生素，1株可以耐受5種抗生素。本研究對于了解禽畜養(yǎng)殖業(yè)中常見的耐藥菌具有一定的理論指導(dǎo)意義，同時也為含有抗生素廢水的處理積累了菌種資源。

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