顏衛(wèi) 趙莎莎 丁麗軍

摘要：由沙門氏菌引起的食物中毒位列我國細(xì)菌性食物中毒首位，引起中毒的食品包括肉、蛋、奶、蔬菜等。雞肉是我國主要的畜禽產(chǎn)品之一，雞在養(yǎng)殖過程中容易受沙門氏菌感染。為了解在食物、動物、人群中沙門氏菌的污染情況，采集江蘇部分地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場和超市的食品樣本、養(yǎng)殖場雞的泄殖腔樣本、人群糞便樣品，對分離到的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，監(jiān)測不同來源菌株的耐藥現(xiàn)狀。研究結(jié)果對于指導(dǎo)臨床合理選擇、正確使用抗菌藥物，降低耐藥茵株的產(chǎn)生具有現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)也為更有效地綜合防治沙門氏菌病提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：江蘇;沙門氏菌;藥敏試驗(yàn);耐藥性;檢出率

中圖分類號： S855.99 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0157-02

沙門氏菌是一種重要的常見人畜共患病原菌，寄生于人和動物腸道內(nèi)，不僅引起家禽的各種疾病如雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒等，還能通過污染的肉類、禽蛋類、蔬菜等食物引起人沙門氏菌感染，國外報(bào)道雞肉中沙門氏菌的檢出率在 13.0%～88.2%[1]，歐洲某些城市雞肉樣品中沙門氏菌平均檢出率為2.7%[2]，細(xì)菌進(jìn)入腸道后大量繁殖，引起腸黏膜發(fā)炎，大量活菌釋放的內(nèi)毒素可引起機(jī)體中毒。國內(nèi)外沙門氏菌引起的食物中毒和食源性疾病的案例一直位居前列，占細(xì)菌性食物中毒的42.6%～60.0%，世界衛(wèi)生組織已將它列為具有嚴(yán)重危害或中等危害的食源性病原菌。

抗生素在疫病防治中發(fā)揮著重要作用，但隨著臨床和養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的不合理使用，沙門氏菌對常用抗菌藥物耐藥情況有逐年増加的趨勢，且其耐藥性可通過食物鏈傳播到人群，一旦耐藥率高且耐藥譜廣的沙門氏菌感染了人，有效抗菌藥物的選擇有限，將導(dǎo)致疾病治療失敗。調(diào)查沙門氏菌的感染情況，監(jiān)測和分析其對不同抗菌藥物的耐藥性，不但能夠?qū)εR床用藥進(jìn)行指導(dǎo)，在公共衛(wèi)生方面也有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、三糖鐵瓊脂（TSI）、腦心浸液肉湯（BHI）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（MH）WS瓊脂，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;科瑪嘉顯色培養(yǎng)基購于鄭州博賽生物技術(shù)研究所;生化鑒定管和標(biāo)準(zhǔn)藥敏片，購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 樣品來源

2016年2—10月，從江蘇部分地區(qū)6個(gè)養(yǎng)殖場不同類型雞中采集328份泄殖腔拭子（棉簽以捻轉(zhuǎn)的方式插入泄殖腔2～3 cm深），從農(nóng)貿(mào)市場、超市采集5類具有代表性的食品樣本，包括生肉類、水產(chǎn)品類、熟肉制品類、生食蔬菜類、生牛奶樣本共452份，采集部分地區(qū)2016年春季飲食行業(yè)工作人員健康檢查的糞便樣品165份進(jìn)行沙門氏菌檢測。

1.3 沙門氏菌的分離

食源樣本中沙門氏菌檢驗(yàn)主要按照GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》，步驟主要為：第一，增菌。25 g樣品加入225 mL緩沖蛋白胨水，37 ℃下培養(yǎng)6～8 h，按1 ∶ 10的比例取前增菌液接種TTB和SC內(nèi)，分別于42、37 ℃ 下培養(yǎng)18～24 h。第二，選擇性培養(yǎng)。增菌液接種科瑪嘉沙門氏顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。經(jīng)沙門氏菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取菌落形態(tài)為紫色或淡紫色、濕潤、大小適中、邊緣整齊光滑的沙門氏菌疑似菌株做革蘭氏染色、鏡檢。沙門氏菌為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌。

泄殖腔樣本接種5 mL TTB增菌液，42 ℃培養(yǎng)24 h，接種環(huán)挑取增菌液劃線科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取紫色單菌落，純培養(yǎng)后作生化鑒定。

人糞便樣本按國標(biāo)方法進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)，主要步驟為：約10 g糞樣置于10 mL SC增菌液中，37 ℃增菌18～24 h，挑取1鉑金耳于WS平板37 ℃分離培養(yǎng)24 h，取疑似菌落接種TSI斜面37 ℃培養(yǎng)18～24 h，可疑菌苔進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，陽性者作生化鑒定。

1.4 沙門氏菌的鑒定

1.4.1 生化鑒定 純培養(yǎng)物分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)，沙門氏菌的生化特征為能分解葡萄糖、甘露醇、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不利用乳糖和蔗糖，能利用枸櫞酸鹽，甲基紅試驗(yàn)陽性，硫化氫試驗(yàn)產(chǎn)生H2S，不分解尿素。

1.4.2 PCR鑒定 采取熱裂解法制備菌株DNA模板：將生化鑒定陽性的菌株接種于2 mL腦心浸肉湯（BHI）中，37 ℃培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液0.5 mL置于Eppendorf管中，離心收集菌體，用滅菌蒸餾水洗滌2次，最后用1 mL蒸餾水懸浮，隔水煮沸15 min，8 000 r/min 離心15 min，取上清制成DNA模板。

擴(kuò)增沙門氏菌的保守基因invA，擴(kuò)增體系為25.0 μL，其中ddH2O 17.5 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、Taq酶2.0 μL、10 μmol/L 引物1.0 μL、DNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?3 ℃ 5 min;93 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像觀察，目的擴(kuò)增片段為284 bp。

1.5 沙門氏菌的耐藥性

將沙門氏菌菌株劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)18 h，挑選菌落接種于MH肉湯37 ℃培養(yǎng)，用生理鹽水校正菌液至合適濃度（1.5×108～3.0×108 CFU/mL）。將菌液用涂布棒均勻涂布于MH表面，稍干后，用無菌鑷子將藥敏紙片平整地貼于瓊脂表面，稍加按壓使紙片貼緊，平板置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從平板背面測量抑菌圈直徑，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源樣本沙門氏菌的污染情況

對452份食源樣品進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定，共檢出11份陽性樣本，總檢出率2.4%（表1）。對分離自養(yǎng)殖場的328份泄殖腔拭子進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定，檢出陽性樣品15份，陽性率4.6%（表2）。165份人糞便樣本分離鑒定出1株沙門氏菌，陽性率為0.6%。

由表1可知，雞肉樣品分離沙門氏菌7株，陽性率7.5%，來源于農(nóng)貿(mào)市場的豬肉樣品分離到3株沙門氏菌，陽性率為5.8%，超市豬肉樣品分離到1株沙門氏菌，陽性率為2.4%。

由表2可知，健康種雞未檢出沙門氏菌率，健康雛雞分離沙門氏菌2株，陽性率2.8%，健康成年雞分離沙門氏菌7株，陽性率4.6%，病雞樣本分離率最高，達(dá)9.4%。

2.2 耐藥率

來源于食品和動物的26株沙門氏菌對6類10種臨床常用的抗微生物藥物的耐藥情況見表3，來源于不同類型樣本的試驗(yàn)菌株耐藥情況見表4。

由表3可知，沙門氏菌對氨芐西林和磺胺異唑的耐藥率最高，達(dá)42.3%;其次為四環(huán)素，耐藥率為30.8%;頭孢唑啉的耐藥率為19.2%;阿莫西林/克拉維酸和慶大霉素的耐藥率為11.5%;環(huán)丙沙星的耐藥率較低，為3.8%;對阿米卡星、頭孢噻呋和頭孢曲松的耐藥率均為0。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)中食物樣品沙門氏菌的污染率為2.4%，污染食品主要為生肉類，其中生雞肉的污染率7.5%，農(nóng)貿(mào)市場生豬肉的污染率5.8%，超市生豬肉的污染率2.4%，與錢靜等的調(diào)查結(jié)果[3]相似，低于何瑞琪等監(jiān)測的污染率[4]。生肉中的較高污染率與肉品銷售場所的衛(wèi)生條件、運(yùn)輸途中保存環(huán)境都有較大關(guān)系。食源樣品中水產(chǎn)品、熟肉制品、蔬菜和生牛奶樣品中均未檢出沙門氏菌，可能與樣本采集量還不夠大有關(guān)。同一類型的豬肉樣本，農(nóng)貿(mào)市場樣本的污染率5.8%高于超市樣本 2.4%，可能與農(nóng)貿(mào)市場內(nèi)不同食品間、肉品與市場污水、市場環(huán)境間的交叉污染、從業(yè)人員的不規(guī)范操作有關(guān)，可見應(yīng)該加強(qiáng)對市場衛(wèi)生的檢疫，加強(qiáng)肉制品屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存以及銷售環(huán)節(jié)的管理，進(jìn)一步規(guī)范從業(yè)人員的操作，從源頭上降低病原菌污染。

養(yǎng)殖場不同類型雞源樣品污染情況存在差異，病雞的沙門氏菌分離率僅為9.4%，可能是由于病料采集前養(yǎng)殖場已使用藥物進(jìn)行治療。健康種雞未檢出沙門氏菌，檢出率低于薛俊龍等的報(bào)道[5]，可能與樣品數(shù)量有關(guān)或是在養(yǎng)殖場過程中，針對沙門氏菌感染，種雞經(jīng)過了長期凈化。從健康雛雞2.8%的感染率到健康成年雞4.6%的污染率，說明隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長， 雞沙門氏菌的感染率有所提高。對比養(yǎng)殖環(huán)節(jié)成年雞4.6%的分離率與市場雞肉樣本7.5%的陽性率，從養(yǎng)殖場到市場沙門氏菌感染率的增高說明在運(yùn)輸過程或農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境間交叉污染的可能性。

抗菌藥物在防治沙門氏菌病中發(fā)揮著重要作用，但隨著藥物使用不當(dāng)引發(fā)的耐藥病原菌也呈逐年遞增趨勢。試驗(yàn)中沙門氏菌對10種藥物的耐藥率在0～42.3%之間。氨芐西林、磺胺異唑和四環(huán)素的耐藥率最高，均在30%以上?；前樊愡?2.3%的耐藥率可能是因?yàn)榕R床應(yīng)用時(shí)沒有堅(jiān)持首次倍量的原則。頭孢唑啉、慶大霉素、阿莫西林、克拉維酸的耐藥率在10%～30%之間。慶大霉素腎毒性較強(qiáng)，臨床上不推薦使用，阿莫西林作為常用的抗沙門氏菌藥，隨著使用的頻繁，耐藥率達(dá)到11.5%。環(huán)丙沙星為合成的第3代喹諾酮類抗菌藥物，26株分離株中只有1株豬肉源分離株對該菌產(chǎn)生耐藥性，雞源沙門氏菌對該抗菌藥敏感，說明目前環(huán)丙沙星在臨床上對雞沙門氏菌的抑菌效果還是較好的。菌株對阿米卡星、頭孢噻呋、頭孢曲松尚未產(chǎn)生耐藥性，頭孢噻呋和頭孢曲松均為第3代頭孢菌素類抗生素，對腸桿菌科細(xì)菌有很強(qiáng)的活性，但價(jià)格較貴，目前主要用于人疾病的臨床治療。

不同來源菌株的耐藥情況也表現(xiàn)出差異性，分離自病雞的菌株主要表現(xiàn)為對磺胺異唑的耐藥（耐藥率>50%）;分離自雛雞的菌株對氨芐西林表現(xiàn)出100%的耐藥;來源于成年雞的菌株主要表現(xiàn)為氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥（耐藥率>50%）;來源于雞肉樣品的菌株主要表現(xiàn)為四環(huán)素的耐藥（耐藥率>50%）。

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