李隴平 白彩霞 朱海鯨

摘要：以轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊與野生型陜北白絨山羊為研究對象，采集其新鮮糞便樣品，用滅菌生理鹽水進行梯度稀釋后，分別接種LB固體培養(yǎng)基、TPY瓊脂、膽硫乳瓊脂、腸球菌瓊脂、伊紅美藍瓊脂和甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)，再分別對平板上生長的所有需氧菌、雙歧桿菌、沙門氏菌、腸球菌、大腸菌群和金黃色葡萄球菌進行菌落計數(shù)，并做顯著性檢驗分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊與野生型陜北白絨山羊糞便中的需氧菌菌群結(jié)構(gòu)之間不存在顯著性差異。研究結(jié)果為轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊安全性評價研究提供了試驗數(shù)據(jù)和研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：VEGF基因;Tβ4基因;轉(zhuǎn)基因陜北白絨山羊;糞便菌群結(jié)構(gòu);生物安全

中圖分類號： S852.6 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0162-03

與動物育種的常規(guī)方法相比，轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有加速育種進程、縮短育種年限、增強種畜性狀穩(wěn)定性、提高育種效率等優(yōu)點。目前，廣泛地應(yīng)用于新品種培育和動物品種改良方面。但是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)從開始到現(xiàn)在一直受到很多爭議，轉(zhuǎn)基因動物的安全性受到人們的質(zhì)疑，而且其涉及面廣、影響深遠。因此，開展對轉(zhuǎn)基因動物安全性評估方面的研究就顯得至關(guān)重要[1-2]。陜北白絨山羊是經(jīng)過國家審定的一個絨肉兼用型的絨山羊新品種，在榆林和延安以及陜西等陜北周邊地區(qū)大量飼養(yǎng)，在地方經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)牧民增收方面起著非常重要的作用。絨山羊的絨和毛分別是由其皮膚的次級毛囊和初級毛囊生成，特別是絨的價格斐然，素有“軟黃金”之譽。毛囊具有高度自我更新能力，它的1個重要特征就是周期性生長，一般經(jīng)歷生長期、退行期和休止期3個階段。毛囊的周期性生長和發(fā)育是多基因參與、緊密聯(lián)系且相互制約的復雜生理生化過程，需要多種生長信號的精細調(diào)控。毛囊的周期性更新生長和血管的新生密切相關(guān)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管新生和退化的變化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，具有促進血管形成[3]，從而促進毛囊發(fā)育[4-5]，并且研究證實VEGF在毛囊生長期表達量最高[6]。胸腺素β4（Tβ4）屬于胸腺素（thymosins）β家族，是重要的一類淋巴細胞因子，作用于毛囊干細胞并激活其分化和遷移，還可以通過促進基質(zhì)金屬蛋白酶的合成分泌影響毛囊發(fā)育生長[7]。在國家轉(zhuǎn)基因重大專項的支持下，2015年筆者所在實驗室利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導轉(zhuǎn)VEGF和Tβ4基因并制備絨山羊胎兒成纖維細胞，最終通過核移植方法分別獲得了轉(zhuǎn)VEGF基因陜北白絨山羊2只（F0代，公羊、母羊各1只）和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊5只（F0代，公羊4只、母羊1只）。隨后，通過本交又獲得了轉(zhuǎn)VEGF基因陽性陜北白絨山羊F1代4只（公羊1只、母羊3只）和轉(zhuǎn)Tβ4基因陽性陜北白絨山羊F1代2只（全部為公羊）。這些轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊的產(chǎn)絨量明顯高于野生型絨山羊，為絨山羊新品種的培育提供了新的育種材料。

為保障人類健康和生態(tài)安全、促進生物技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展，我國對于轉(zhuǎn)基因動物的研究、開發(fā)和審批過程嚴格遵守法制化管理，并制定了一系列法律法規(guī)。其中，轉(zhuǎn)基因動物自身健康和福利、環(huán)境安全、人類健康和食品安全是對轉(zhuǎn)基因動物生物安全評價研究關(guān)注的核心問題。對于轉(zhuǎn)基因動物的自身安全性，除了須要關(guān)注轉(zhuǎn)基因動物生長、發(fā)育、生理活動、主要器官等各個方面，對于轉(zhuǎn)基因動物的胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)變化也是重點研究的方面。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道微生態(tài)平衡對于維持動物良好的生理代謝、疾病預防、免疫和營養(yǎng)代謝等諸多方面都起著重要作用[8-10]。然而，目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物胃腸道微生物區(qū)系變化的研究鮮見報道，只見對轉(zhuǎn)sFat-1基因豬的胃腸道及糞便樣品中微生物菌群變化研究的報道[11]。本試驗通過分析轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因及野生型陜北白絨山羊F1、F0代糞便在LB固體培養(yǎng)基及TPY瓊脂、膽硫乳瓊脂、腸球菌瓊脂、伊紅美藍瓊脂和甘露醇鹽瓊脂不同培養(yǎng)基中的細菌菌落生長情況并計數(shù)，通過統(tǒng)計分析討論轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊糞便中微生物是否存在顯著性差異，為轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊生物安全評價研究提供試驗數(shù)據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2016年7—12月，在陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心進行。

1.1 試驗動物

榆林學院西區(qū)試驗羊場轉(zhuǎn)VEGF基因陜北白絨山羊F0代公羊和母羊各1只，轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊F0代公羊3只、母羊1只;轉(zhuǎn)VEGF基因陜北白絨山羊F1代公羊1只、母羊3只，轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊F1代公羊2只;野生型陜北白絨山羊公羊、母羊各3只。

1.2 試驗試劑

TPY瓊脂（HB0397）、EMB伊紅美藍瓊脂（HB0107）、BEA腸球菌瓊脂（HB0133）、DHL膽硫乳瓊脂（HB4087）和MSA甘露醇鹽瓊脂（HB4128-2），購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集與預處理 選取健康、體況良好的轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊和野生陜北白絨山羊F0與F1的新鮮糞樣樣品，做好標記，低溫保存，立即送回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.3.2 微生物培養(yǎng)與計數(shù) 分別稱取1 g糞便樣品，加入到裝有9 mL滅菌水的離心管，并做好標記，輕輕振蕩混合均勻之后并對其進行梯度稀釋。選擇2～3個合適的稀釋度，注入已做好標記的滅菌培養(yǎng)皿中，然后迅速倒入20 mL滅菌后平衡至50 ℃的不同類型的瓊脂培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其中的培養(yǎng)基與菌液混合均勻，待培養(yǎng)基凝固（每個稀釋度做3個，過程中注意無菌操作）后，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，觀察在不同瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)并計數(shù)。

1.3.3 菌落計數(shù) 菌落計數(shù)方法：肉眼觀察菌落并計數(shù)。試驗結(jié)果報告方法如下：（1）首先選取各稀釋度的平均菌落數(shù)在30～300個之間的平板，當只有1個稀釋度的平均菌落數(shù)在30～300個之間時，以其稀釋倍數(shù)乘以其菌落數(shù)報告。（2）當其中有2個稀釋度的平均菌落數(shù)都在30～300個之間，就按照這2個稀釋度的菌落總數(shù)的比值來判定（當比值<2時，報告這2個平均菌落數(shù)的平均值;當比值>2時，報告這2個平均菌落數(shù)當中比較小的菌落總數(shù)）。（3）當每個稀釋度的平均菌落數(shù)都>300個時，按照稀釋倍數(shù)乘以其中稀釋度最高的平均菌落數(shù)來報告。（4）當每個稀釋度的平均菌落數(shù)都<30個時，按照稀釋倍數(shù)乘以其中稀釋度最低的平均菌落數(shù)來報告。（5）當每個稀釋度的平均菌落數(shù)都不在 30～300個時，應(yīng)按照其中最接近30個或300個的平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)來報告。（6）當報告的菌落數(shù)在100個以內(nèi)時，應(yīng)按照其實際數(shù)據(jù)報告;>100個時，采用2位有效數(shù)字來表示;在2位有效數(shù)字后面的數(shù)值，按照四舍五入的方法計算。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”形式來表示。采用t檢驗對試驗結(jié)果進行顯著性分析：P<0.05，差異顯著;P>0.05，差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

轉(zhuǎn)基因與野生型陜北白絨山羊的糞便樣品在不同選擇性培養(yǎng)基上的菌落生長情況見圖1。

2.2 糞樣中需氧微生物菌落

轉(zhuǎn)VEGF基因與轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊和野生型陜北白絨山羊F0代、F1代公羊和母羊糞便中所有需氧菌、雙歧桿菌、腸球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸菌群的試驗數(shù)據(jù)見表1至表4。t檢驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)FGF5s基因與轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊和野生型陜北白絨山羊糞便微生物菌群之間沒有顯著性差異。

3 討論

細菌菌群通過排泄物從轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊釋放到環(huán)境中，因此，糞便是用來研究轉(zhuǎn)基因絨山羊體內(nèi)各種微生物變化和轉(zhuǎn)基因動物自身健康狀況的有效載體，能夠準確反映腸道微生物的變化情況，同時也避免了在轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因數(shù)量不多的情況下對其進行宰殺。腸道內(nèi)微生物菌群平衡是動物機體健康狀態(tài)的重要標志，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道微生態(tài)平衡對于維持動物良好的生理代謝、疾病預防、免疫和營養(yǎng)代謝等諸多方面都起著重要作用[8-10]。當轉(zhuǎn)入外源VEGF和Tβ4基因后，在增加絨山羊絨毛品質(zhì)和產(chǎn)量的同時，絨山羊胃腸道菌群的種類、數(shù)量和比例可能會受到一定程度的影響。所以，轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊安全性評價研究中，有必要對糞便中微生物菌群結(jié)構(gòu)及其變化進行分析。本試驗選用6種不同培養(yǎng)基分別對轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊和野生型陜北白絨山羊糞便中微生物進行培養(yǎng)、計數(shù)及統(tǒng)計分析，在以小鼠為模型研究轉(zhuǎn)基因小鼠安全性的試驗中，也是以這6種指示菌作為目標菌進行分析[12-13]。在這些微生物中，大腸菌群和沙門氏菌與動物的生理代謝相關(guān)，而雙歧桿菌、大腸桿菌群和腸球菌是動物消化道中的主要優(yōu)勢菌群[14]。所以，研究這些菌群在轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊體內(nèi)的變化是非常有意義的。

研究結(jié)果表明，F(xiàn)0代和F1代轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊與野生型陜北白絨山羊糞便中細菌菌群的組成和結(jié)構(gòu)沒有顯著性差異（P>0.05），主要有益菌和有害菌的組成和菌群結(jié)構(gòu)與對照組相比都沒有發(fā)生變化。這些研究結(jié)果與對轉(zhuǎn)PEPCK-1基因豬[15]和轉(zhuǎn)eGFP基因小鼠[16]的生物安全評價的研究結(jié)果一致。筆者的研究工作不僅積累了對轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊安全性評價研究的數(shù)據(jù)，而且也為其他轉(zhuǎn)基因動物的安全性評價研究提供了思路。

4 結(jié)論

本試驗使用LB固體培養(yǎng)基及TPY瓊脂、膽硫乳瓊脂、腸球菌瓊脂、伊紅美藍瓊脂和甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基，對轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊及野生型陜北白絨山羊F0及F1代糞樣分別進行培養(yǎng)、計數(shù)、統(tǒng)計分析，結(jié)果表明兩者并無顯著性差異（P>0.05），說明轉(zhuǎn)VEGF基因和轉(zhuǎn)Tβ4基因陜北白絨山羊糞便中需氧微生物與野生型陜北白絨山羊不存在顯著性差異，研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因陜北白絨山羊的安全性評價研究提供了試驗數(shù)據(jù)和研究基礎(chǔ)。

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