老鴉瓣葉中黃酮成份的提取及初步鑒定

余曉雪，蘇 暢，周龍飛，史勁松

(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

老鴉瓣(Tulipaedulis( Miq.) Baker)為百合科(Liliaceae)郁金香屬(Tulipa)植物，目前主要來(lái)源為野生，廣泛分布于安徽、河南、江蘇、山東等地，春、秋、冬季均可采收[1]。中藥光慈菇為其去掉膜質(zhì)皮和絨毛后的干燥鱗莖，曬干或鮮用，其味甘、辛，性寒，有小毒，具有清熱解毒、散結(jié)消腫的功效，主治咽喉腫痛、瘰疬結(jié)核、瘀滯疼痛、癰癤腫毒、蛇蟲(chóng)咬傷等[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，光慈菇對(duì)于乳腺癌的治療具有顯著的效果，臨床也有用于輔助治療咽喉癌、淋巴瘤的報(bào)道[3]。由于使用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大而適生環(huán)境日益減少等多種原因，自然野生藥材供求矛盾較為突出[4]。

為緩解野生藥材供應(yīng)問(wèn)題、促進(jìn)中藥資源的合理利用，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者陸續(xù)對(duì)中藥非藥用部位進(jìn)行了更加深入的藥化、藥理和臨床應(yīng)用的探索[5]。老鴉瓣在每年的農(nóng)歷初春之際開(kāi)始長(zhǎng)出嫩葉，一般為雙片，江蘇、安徽等地俗稱其為雙芽頭、雙芽子，芽葉凌霜而生，因而又有“霜芽”之稱。我國(guó)部分地方有采摘食用老鴉瓣嫩葉的習(xí)慣。目前在安徽亳州、蒙城等市縣，老鴉瓣有一定規(guī)模的人工栽培，但以獲取花、葉為主?；ㄈ~作為老鴉瓣的非藥用部位，目前相關(guān)研究還不深入，需要明確花葉是否存在特定的藥用成分，或進(jìn)行功能食品開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

黃酮類化合物是一類廣泛分布在植物中天然活性產(chǎn)物，具有極為廣泛的生理活性作用，如抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血脂、降血壓、治療心腦血管疾病、抗炎、抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛、提高免疫、對(duì)消化性潰瘍的保護(hù)作用等藥用保健功能，其次在食品，化妝品等行業(yè)中具有很高的利用價(jià)值。本研究對(duì)老鴉瓣嫩葉進(jìn)行了干燥，初步進(jìn)行成分分析后，發(fā)現(xiàn)其存在較多的黃酮成分，進(jìn)而研究了黃酮的超聲波輔助提取，并通過(guò)條件優(yōu)化得到了最佳提取工藝，為老鴉瓣生物質(zhì)資源的合理利用和栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

UV-2100紫外分光光度計(jì)(尤尼可上海儀器有限公司)；MS104S電子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-800KDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Himac CR22G臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)等。

1.2 試劑與樣品

蘆丁對(duì)照品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)20181011)；乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等均為分析純；水為蒸餾水。

樣品由蒙城縣南望槐種植專業(yè)合作社提供，經(jīng)對(duì)其DNA中ITS2序列測(cè)定，鑒定為老鴉瓣(Tulipaedulis)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

新鮮老鴉瓣清洗后80℃漂洗30 s，真空干燥箱60℃將其烘干至水分<5%，再用實(shí)驗(yàn)型粉碎機(jī)將干燥樣品粉碎成末，備用(圖1)。

1.3.2 老鴉瓣中黃酮物質(zhì)的提取及條件優(yōu)化

取老鴉瓣葉粉末約2 g，精密稱定后至三角瓶中，加入一定體積、體積分?jǐn)?shù)濃度的乙醇溶液，在一定功率下進(jìn)行超聲波輔助提取。提取結(jié)束后，取上清液5 ml，加無(wú)水乙醇稀釋至10 ml，離心后取上清0.5 ml，用去離子水定容至2.0 ml作為樣品，按后續(xù)總黃酮測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算黃酮提取率。按照上述基本實(shí)驗(yàn)方法，研究超聲波不同設(shè)定功率、乙醇不同體積濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響。

正交試驗(yàn)優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)做L9(33)正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平表Table1 Orthogonal test factors and levels

1.3.3 黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品14 mg，加60%乙醇加熱溶解并定容至50 ml。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0 ml置具塞比色管中，用去離子水定容至2.0 ml，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 ml，搖勻，室溫下放置6 min，加入0.5 ml 10%硝酸鋁溶液，室溫下放置6 min，加入2 ml 1 mol/L NaOH混勻。室溫下放置15 min，在波長(zhǎng)為500 nm的條件下測(cè)定吸光度。

黃酮含量的測(cè)定：測(cè)定提取物在500 nm下的吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線方程，計(jì)算提取物黃酮總含量。

1.3.4 老鴉瓣中黃酮物質(zhì)的HPLC初步鑒定

稱取老鴉瓣葉黃酮粗提物粉末50 mg于250 mL三口燒瓶中，加入20 mL甲醇，搖勻，加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的HCl溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)，90℃加熱回流1 h，冷卻至室溫后用甲醇洗滌并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，搖勻，用甲醇定容至刻度，即得老鴉瓣葉黃酮粗提物供試品水解反應(yīng)后的樣品溶液。以該樣品液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算得老鴉瓣葉黃酮中不同種類黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

圖1為新鮮的老鴉瓣葉，長(zhǎng)度約為12-15 cm，含水率在92%以上，其新鮮芽葉在4℃冰箱可以存儲(chǔ)一周，因此需要進(jìn)行及時(shí)處理。老鴉瓣葉清洗后采用80℃熱水進(jìn)行漂洗30 s，然后真空烘干，粉碎后可得到青色細(xì)粉(圖1)。

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

為測(cè)定老鴉瓣葉芽中黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，首先進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定和繪制(圖2)，由圖中曲線可以回歸得到蘆丁濃度X(mg/ml)和吸光度Y的關(guān)系曲線y=0.3576x-0.0014，其R2=0.9994，說(shuō)明蘆丁濃度和吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖1 新采摘的老鴉瓣葉及其干燥粉碎后的樣品Fig.1 Freshly picked corvid leaves and dried crushed samples

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of rutin

2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

在超聲功率為80 W的條件下，分別提取30、45、60、75 min，以此研究超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。結(jié)果表明，隨著超聲提取時(shí)間增大，老鴉瓣葉粉末中總黃酮的提取率逐步增大，在60 min處獲得最高提取率，而后開(kāi)始下降，因此適宜的超聲時(shí)間為60 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate

2.3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

按照基本提取工藝方案，保持其他條件不變，分別以體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液進(jìn)行黃酮提取，研究乙醇濃度對(duì)提取率的影響。由圖4可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，老鴉瓣芽葉中黃酮可達(dá)到6%以上的提取率，但當(dāng)乙醇濃度大于80%時(shí)，提取率隨之快速下降。推測(cè)主要原因?yàn)楦邼舛纫掖嫉闹苄陨仙?，極性下降，而黃酮作為多羥基化合物，需要提取溶劑保持一定的極性。同時(shí)，高濃度乙醇的提取液色素溶出增多，對(duì)總黃酮的檢測(cè)結(jié)果有一定的干擾，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)以60%為宜。

圖4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield

2.4 料液比對(duì)提取率的影響

以上述優(yōu)化的參數(shù)為基礎(chǔ)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取功率80 W、提取時(shí)間為60 min的條件下，考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對(duì)黃酮提取率的影響(圖5)，圖中顯示，總黃酮提取率隨著料液比的增大先快速增大，但在1∶30之后不再進(jìn)一步增大，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。過(guò)高的料液比并不能增加黃酮成分的有效提取，而且會(huì)造成后續(xù)處理的工作量。因此，料液比可以控制在1∶30。

2.5 超聲功率對(duì)提取率的影響

進(jìn)一步考察超聲功率為60、70、80、90、100 W對(duì)提取率的影響。由圖6可知，80 W時(shí)黃酮的提取率最高，之后迅速下降，推測(cè)可能是超聲波對(duì)部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)造成破壞，或者是促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)與其他物質(zhì)的反應(yīng)。因此選擇超聲功率為80 W最優(yōu)。

圖5 料液比對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of material - liquid ratio on extraction rate

圖6 超聲功率對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on extraction rate

2.6 超聲提取老鴉瓣葉總黃酮的正交結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)做L9(33)正交試驗(yàn)，正交結(jié)果見(jiàn)表二。由結(jié)果分析可知，不同因素對(duì)總黃酮提取效果的影響順序?yàn)锳>C>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>提出時(shí)間>料液比，老鴉瓣葉最佳提取條件為A2B2C3,即60%乙醇溶液，料液比1∶30，提取時(shí)間為60 min，此條件下，黃酮的提取率可以達(dá)到6%以上。

2.7 HPLC初步鑒定老鴉瓣中黃酮類物質(zhì)

選擇兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素六種黃酮作為對(duì)照品，通過(guò)HPLC法測(cè)定六種黃酮在208nm處的峰面積，計(jì)算其含量。分析表明，老鴉瓣黃酮中至少含有蘆丁、楊梅素、山奈酚等黃酮成分，其中蘆丁含量最高，為35.6 mg/L，其他幾種成分含量低，還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

圖7 混標(biāo)HPLC測(cè)定圖Fig.7 HPLC diagram of mixed standard

圖8 樣品的HPLC測(cè)定圖Fig.8 HPLC diagram of the sample

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)兒茶素0.89蘆丁35.6楊梅素2.35槲皮素0.87山奈酚4.63異鼠李素0.69

2 結(jié)論與討論

老鴉瓣葉芽中含有6%以上的粗黃酮，具有較高的利用價(jià)值。本文研究了老鴉瓣葉

中總黃酮的提取條件，比較了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，確定最佳提取工藝為60%乙醇溶液、料液比為1∶30，超聲功率為80 W，提取60 min；經(jīng)HPLC初步鑒定，老鴉瓣黃酮類物質(zhì)主要包括蘆丁、楊梅素、山奈酚等種類，可為老鴉瓣葉的生物制資源合理應(yīng)用提供依據(jù)。