柴 華 劉鑫瑩 李建華

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150000）

豬腎上皮細(xì)胞（PK-15）來(lái)源于豬腎，源自成年豬腎細(xì)胞PK-2a，體外貼壁生長(zhǎng)，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。該細(xì)胞對(duì)豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等多種病毒敏感，在疫苗生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。

本研究對(duì)PK-15細(xì)胞的基本生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，旨在開(kāi)展PK-15細(xì)胞及多種疫苗的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試驗(yàn)用PK-15細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所）；DMEM（購(gòu)自美國(guó)gibco）；新生牛血清（購(gòu)自美國(guó)CLARK）；0.25%胰蛋白酶（購(gòu)自美國(guó)gibco）；秋水仙素（購(gòu)自美國(guó)sigma）。

供試驗(yàn)儀器為CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisher，參數(shù)設(shè)置為37℃，5% CO2），相差倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇

自液氮罐取出一支凍存PK-15細(xì)胞，于37℃水浴鍋中解凍，離心后棄掉上清，用培養(yǎng)基重懸后接種至細(xì)胞瓶中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生達(dá)到90%%匯合度時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞傳代

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，加入0.25%的胰酶消化液，將方瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，待觀察到個(gè)體清晰、細(xì)胞之間界限分明時(shí)，搖晃細(xì)胞從瓶壁上脫落時(shí)，培養(yǎng)基終止膜酶消化作用，吹打至形成單細(xì)胞懸液，按密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 鑒定

（1）細(xì)胞形態(tài) 用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

（2）生長(zhǎng)曲線(xiàn) 將PK-15細(xì)胞按密度為4.0×105cells/ml接種至T25細(xì)胞瓶中，每隔24h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

（3）無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

（4）支原體檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

（5）外源病毒檢測(cè)

取待檢細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，接種Vero細(xì)胞、MDBK細(xì)胞和ST細(xì)胞。細(xì)胞單層樣品經(jīng)甲醇定后，用適宜的熒光抗體進(jìn)行染色，檢查每一組細(xì)胞單層是否存在牛病毒性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒和豬瘟病毒外源病毒的熒光。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)特異熒光，正常細(xì)胞無(wú)熒光時(shí)，如果被檢樣品出現(xiàn)外源性病毒特異性熒光，判為存在相應(yīng)病毒污染而樣品不合格。

（6）胞核學(xué)檢查

取PK-15細(xì)胞，加入含0.1μg/ml 秋水仙素的培養(yǎng)液作用2～4h，離心棄去培養(yǎng)液。用Eargle's 等滲鹽水清洗，離心棄去液體，加入含1%酚紅的低滲液（1L水加入4滴1mol/L NaHCO3），37℃作用30min。加入醋酸/甲醛固定液，與細(xì)胞反應(yīng)25min。在加熱板上加熱至60℃左右，滴加1mol/L鹽酸作用10min。用姬姆薩染色液染色后油鏡下觀察，取50個(gè)處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查，對(duì)染色體計(jì)數(shù)，觀察染色體組型。

（7）細(xì)胞致瘤性檢驗(yàn)

用裸鼠20只，隨機(jī)分成3組。第一組10只裸鼠，各皮下接種107個(gè)PK-15細(xì)胞；第二組5只裸鼠，各經(jīng)皮下接種107個(gè)人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）作為陽(yáng)性對(duì)照；第3組5只裸鼠，各經(jīng)皮下接種107個(gè)人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）作為陰性對(duì)照。接種后逐日觀察有無(wú)結(jié)節(jié)或腫瘤形成，21日剖檢第1組裸鼠5只；剩余5只裸鼠，繼續(xù)觀察，12周后全部剖檢。陽(yáng)性和陰性對(duì)照組觀察21日全部剖檢，剖檢后觀察淋巴結(jié)和器官有無(wú)結(jié)節(jié)形成。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

PK-15細(xì)胞置顯微鏡下觀察如圖1，細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，輪廓清晰，細(xì)胞形態(tài)較好。

圖1 PK-15細(xì)胞

2.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)成S型，如圖2，細(xì)胞生長(zhǎng)經(jīng)歷了潛伏期、增殖期和停滯期。其中，細(xì)胞在48～120h增殖較快，細(xì)胞培養(yǎng)72h細(xì)胞密度約為43.0×105cells/ml。

圖2 細(xì)胞增殖曲線(xiàn)

2.3 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，PK-15細(xì)胞檢驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4 支原體檢驗(yàn)結(jié)果

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，PK-15細(xì)胞檢驗(yàn)結(jié)果為支原體陰性。

2.5 外源病毒檢測(cè)結(jié)果

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行PK-15細(xì)胞檢測(cè)，熒光抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性，結(jié)果如圖3、圖4和圖5。

圖3 BVDV熒光抗體檢測(cè)結(jié)果

2.6 細(xì)胞致瘤性檢驗(yàn)

將PK-15細(xì)胞頸部皮下接種裸鼠，21日及12周剖檢裸鼠，裸鼠各個(gè)淋巴結(jié)和器官均無(wú)結(jié)節(jié)形成，陽(yáng)性對(duì)照組5/5出現(xiàn)明顯腫瘤，陰性對(duì)照組裸鼠均無(wú)結(jié)節(jié)形成，PK-15細(xì)胞無(wú)致瘤性。

2.7 胞核學(xué)檢查

細(xì)胞染色體標(biāo)本經(jīng)姬姆薩染色，對(duì)有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查，染色體數(shù)為19×2，染色體形態(tài)見(jiàn)圖6。

圖4 CSFV熒光抗體檢測(cè)結(jié)果

樣品

圖5 PPV熒光抗體檢測(cè)結(jié)果

圖6 PK-15細(xì)胞染色體

3 結(jié)論

本研究對(duì)PK-15細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)鑒定、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、核型分析及致瘤性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，PK-15細(xì)胞為純凈細(xì)胞株。

PK-15細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中能保持相對(duì)穩(wěn)定的遺傳特性，為疫苗的生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。同時(shí)，豬圓環(huán)病毒，豬細(xì)小病毒等病毒能夠在PK-15細(xì)胞系中穩(wěn)定、高效價(jià)的增殖，也為豬細(xì)圓環(huán)病毒疫苗及豬細(xì)小病毒滅活疫苗的研究及開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。